Эта мера может помочь ответить на ключевые вопросы. В области гуманизма. Этот ответ в функции макрофагов при физиологическом конце патологических состояний.
Основным преимуществом этой техники является то, что полиэтилеймин покрытием может эффективно en vitro без ущерба для клеток. При оптимальных дозах. Последствия этого метода распространяются на терапию и диагностику многих хронических воспалительных расстройств и рака.
Где макрофаги играют важную роль в патогенеза. Демонстрация процедуры будет Na Jia. Аспирант из моей лаборатории.
И Кайсуань Ван аспирант лаборатории доктора Сяохуа. Для приготовления эллиновой кислоты модифицированные супер парамагнитные наночастицы оксида железа или первый СПБИОН добавить 28 граммов хлорида хлорида гексагидрата. И 20 граммов фараонов самостоятельного гептагидрата в стакан, содержащий 80 миллилитров деионизированной воды.
И использовать стеклянный канал для введения азота в раствор. Перемешивание до тех пор, пока твердая материя не растворится. Нагрейте реакционной смеси до 72 градусов по Цельсию с перемешиванием при 800 вращениях в минуту.
И добавить 40 миллилитров 28%аммиачной воды в стакан. Через пять минут добавить девять миллилитров эллиновой кислоты падение мудрым. И поддерживать смесь при 72 градусах по Цельсию в течение трех часов с непрерывным перемешиванием.
В конце инкубации охладить полученный раствор до комнатной температуры. И осаждать смесь через магнитное разделение в соответствии со стандартными протоколами. Затем мыть SPION содержащие осадки в три раза с абсолютным этилового спирта.
И asperse осадков в 100 миллилитров n-hexane. Для подготовки димеркапто акриловой кислоты модифицированные SPION добавить 800 миллиграммов эллиновой кислоты модифицированных SPION's. Рассеянные в 200 миллилитров n-hexane и 400 миллиграммов димеркапто акриловой кислоты рассредоточены в 200 миллилитров ацетона в три шеи колбу в водяной бане при 60 градусов по Цельсию.
Далее добавить 200 микролитров триэтиламина падение мудрым в колбу с перемешиванием на 1000 вращений в минуту и рефлюксирования. Черный осадок может быть получен путем магнитного разделения через пять часов. Затем используйте тетраметиламмоний гидроксида для регулировки рН раствора для однородного рассеивания гидрофильных SPION в деионизированной воде.
Дегенеративная полиэтиленовая покрытие SPION добавить димеркапто акриловой кислоты модифицированного коллоидного раствора SPION падение мудрым в 10 килодальтон полиэтиленового раствора. В 500 миллилитров три шеи колбу под механическим перемешиванием при 1000 вращений в минуту в течение двух часов. В конце инкубации добавьте полученный раствор в ультрафильтральную трубку с молекулярной массой, отрезанной от 100 килодальтонов и содержанием 15 миллилитров.
Центрафуз образец до тех пор, пока оставшийся раствор не достигнет одного миллилитрового объема. Добавьте деионизированную воду в раствор, чтобы вернуть объем до 15 миллилитров. И centrafuse и регидратировать решение еще в десять раз, как только что продемонстрировали.
Затем отфильтруйте раствор через фильтр емкостью 22 микрона для хранения при четырех градусах Цельсия. Для подготовки наночастиц siRNA сначала добавьте три микролитров свежеприготовленных 20 растворов микромолярной сирны в пять свободных микроцентроафированных труб РНК. И добавить 0, 8, 1,6, 3,2 и 6,4 микрограмма полиэтиленемин SPION в трубки помечены ноль, один, два, четыре и восемь соответственно.
После смешивания с нежным пипетки, инкубировать образцы в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы полиэтилеймин SPION siRNA комплексов для формирования. И подготовить три процента агарозный гель с I чистоты агарозы. В конце инкубации добавьте один микролитер буфера загрузки 6X на пять микролитров образца к каждой трубке и тщательно перемешайте.
Затем загрузите все образцы на гель. И запустить электрофорез на пять вольт на сантиметр. До бромофено голубой краситель мигрирует две трети длины на гель.
За день до трансфекции мыть микрофагов мыши, как RAW264.7 клеточной культуры с PBS. И лечить клетки с одним миллилитром 25%трипсина в течение пяти-десяти минут при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентном инкубаторе двуокиси углерода. Когда большинство клеток отсоединились.
Инактивировать трипсин с пятью миллилитров полного DMEN. Затем pippete решение несколько раз, чтобы разогнать любые кластеры клеток. Перенесите подвеску клетки в стерильную 15-миллилитровую конакльную трубку для центрифугации.
Затем повторно приостановить клетки в пять миллилитров свежего полного DMEN для подсчета. Разбавить клетки в 4,5 раза десять до четвертого клетки на миллилитр полной концентрации DMEN. И добавить два миллилитров среднего к каждому хорошо из шести пластины хорошо в течение 24 часов инкубации в инкубаторе культуры клеток.
На следующий день подготовить соответствующее соотношение полиэтилеймин SPION siRNA наночастиц в 1,5 миллилитров РНК поток микроцентрифуг трубки с нежным смешивания, как только что продемонстрировано. И добавьте соответствующий объем полиэтиленового комплекса SIRNA siRNA к каждой колодец, который был заменен на один миллилитр свежей среды. Подготовка полиэтиленовых комплексов SPION si.
в этом случае еще много месяцев полиэтилена SPION могут быть использованы Таким образом, минимизируя их потенциальную токсичность. Затем тщательно закружить пластину для достижения равномерного распределения наночастиц по днищам хорошо. Верните пластину в инкубатор клеточной культуры до последующего клеточного обновления или анализа дефицита нокдауна генов.
Политетилеймин СПИОН с потенциалом зеты 30,5 и 37 милливольт не обладают очевидной цитотоксичности в концентрациях до 30 микрограммов железа на миллилитр. Что примерно в два раза больше, чем концентрация, обычно используемая для трансфекции клеток. Polyethyleneimine SPION в zeta потенциал 48 милливольт однако являются токсичными.
Даже при самой низкой дозе обследовано. Как анализируется цитометрии потока, более 90% клеток могут быть трансфицированы флуоресцентно помечены полиэтиленовые комплексы SPION siRNA на 15 микрограммов железа на миллилитр. Оценка влияния полиэтиленовых концентраций SPION siRNA на клеточной интернализации путем дробления синего окрашивания показывает минимально обнаруживаемое окрашивание на 7,5 микрограмма железа на миллилитр.
Но хорошо видны пятна на 15 микрограмм железа на миллилитр, которые не увеличиваются при более высоких концентрациях железа, вероятно, из-за полиэтилемин SPION siRNA поглощения насыщения. Перитонеальные макрофаги, трансфицированные полиэтиленом SPION в укрывательство конкретных siRNA экспонат значительное снижение уровня targe mRNA по сравнению с неспецифической siRNA. Предполагая, что siRNA может вырваться из эндоцитических пузырьков в цитоплазму, чтобы достичь РНК-интерференционного механизма.
Далее после внутривенного введения разовой дозы полиэтилена SPION siRNA наночастиц комплексов flocentimetrical анализ CD11b положительных и CD3 положительных клеток показывает более эффективное поглощение наночастиц CD11b, выражающий макрофаги, чем CD3 положительные клетки в любой момент времени во всех исследованных органах. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы подготовить полиэтиленемин SPION со средним потенциалом данных не выше 37 милливольт и подготовить полиэтиленемин SPION siRNA комплексов на низких коэффициентов железа к siRNA. Этот метод сравнивает потребность для исследователей исследовать терапевтический потенциал пристреливания макрофагов в животных двигателях людских заболеваний such as и рак.
