Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экологической токсикологии о распределении подоборов и концентрации тяжелых металлов в биологических системах. Основным преимуществом этой методики является то, что AMG является простой в использовании и недорогой методологией, то есть ценным адъювантом для исследования тяжелых металлов в тканях. Мы используем ткани дельфинов и китов, чтобы продемонстрировать протокол.
Тем не менее, мы считаем, что протокол может быть использован в различных видах животных. Демонстрацией процедуры с Вэнь-Та Ли будет Шунь Тхэн, врач из нашего института. Начните с сбора парных тканей печени и почек для анализа AMG с застрявшего китообразных и фиксации ткани в 10 раз больше объема 10%нейтрального буферного формалина в течение 24-48 часов.
Затем используйте одноразовые лезвия микротомы из нержавеющей стали, чтобы обрезать ткани печени и почек, закрепленные формалином, на два сантиметра на один сантиметр, трехмиллиметровые секции, а также поместить секции печени и почек от одного и того же человека в одинаковые кассеты с этикеткой. Обезвоживание секций в тканевой процессор через серию градуированных этанола и ксилена погружений, а затем один час и два часа парафин погружения. После двухчасового парафинового погружения перенесите ткани на дно стальных гистологических форм и ввелите обезвоженные образцы тканей со свежим расплавленным парафином.
Охладить формалин фиксированной, парафин-встроенных блоков ткани на холодной пластине, пока парафин затвердевает, и обрезать каждый блок на микротоме, пока поверхность ткани подвергается. Охладите образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 10 минут и получите секции пятимиметровой ткани на микротоме. Используя пинцет и щетки, поднимите ленты секции тканей по мере их приобретения и поплывуйте по поверхности двухгодостильной водяной бани 45 градусов по Цельсию, пока они не будут разделены, и поместите их на отдельные слайды микроскопа.
Затем поместите горки на слайд теплее в течение одного часа, при 60 градусах по Цельсию. Затем поместите слайды в слайд стеллажи, и де-парафинизировать разделы в трех различных окрашивания блюда, содержащие от 200 до 250 миллилитров чистого не-ксилена в течение восьми-пяти-и трехминутных инкубаций. Гидрат де-паррафинированных образцов в различных окрашивания блюд градуированных растворов этанола, а затем полоскания в двойной дистиллированной воды.
Промыть разделы один раз в PBS дополняется 5%Triton X 100, несколько раз в PBS в одиночку, и один раз в свежей двойной дистиллированной воды в течение 30 секунд за стирку. После последней стирки, этикетка каждого образца с 300 микролитров смешанного серебра комплект решения, в течение не более 15 минут в темноте при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть горки с двойной дистиллированной водой, и контр-пятно разделов в 300 микролитров гематоксилина на слайд, в течение 10 секунд.
Вымойте горки проточной водопроводной водой. Высушите их и смонтировать секции с монтажной среды. Затем захват 10 случайных гистологических изображений каждой части ткани, под 40X цель светового микроскопа.
Чтобы проанализировать автометаллографию, или AMG, положительность образцов, откройте изображения в соответствующей программе анализа изображений, а также выберите изображение, тип и RGB стек, чтобы разделить первое изображение на красный, синий и зеленый цвет каналов. В синем канале выберите изображение, отрегулируйте и порог, чтобы измерить процент области с AMG-положительными сигналами в каждом изображении, вручную регулируя значение выреза для порога каждого изображения в зависимости от наличия ложноположивых областей в ядрах, или красных кровяных телец. Нажмите анализ, и установить измерения, и проверить площадь фракции, чтобы указать, что площадь фракции записывается.
Нажмите проанализировать и измерить, чтобы отобразить положительную процентную область каждого гистологического изображения в процентах от столбца окна результата. Для оценки корреляции между результатами индуктивно-соединенной плазменной массы спектроскопии и AMG-положительными значениями откройте соответствующее программное обеспечение для графики. Создайте новый файл проекта и выберите XY и корреляцию.
Вввесть результаты индуктивно-соединенной плазменной массы спектроскопии и AMG анализов, а также выбрать анализ, и корреляции, чтобы проанализировать прочность связи между результатами анализа пирсон корреляции анализа. В параметрах, нелинейном окне регрессии, выберите другую модель регрессии на подгонки страницы и выберите методы сравнения на странице сравнения. Включите дополнительную сумму квадратов F-теста и информационный критерий Акаике.
Согласно результатам методов сравнения, выберите относительно соответствующую регрессивную модель в китообразных гистологических серебряных анализах, а также используйте анализ для оценки концентрации серебра в китообразных тканях печени и почек с неизвестными концентрациями серебра. AMG-положительные сигналы включают вариативно размера, коричневый до черного гранулы в цитоплазме гепатоцитов и клеток Купфера, а иногда и аморфные, золотисто-желтые и коричневые AMG-положительные сигналы в люмене и мембране подвала некоторых проксимальных почечных трубочек. Существует положительная корреляция между результатами индуктивно-соединенной плазменной массы спектроскопии и значениями положительности AMG в анализируемой ткани печени и почек, с предпочтительной линейной регрессией через происхождение, согласно дополнительной сумме квадратов F-теста, и информационным критерием Акаике.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что метод AMG является адъювантным методом, и должны быть использованы с другим конкретным методом, таким как ICPMS, для мониторинга фактического состава тяжелых металлов в тканях.
