이 방법은 생물학적 시스템 내의 중금속 의 하위 기관 분포 및 농도에 대한 환경 독성학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 AMG가 사용하기 쉽고 저렴한 방법론이며, 이는 조직에서 중금속을 조사하기위한 귀중한 보조제라는 것입니다. 우리는 돌고래와 고래의 조직을 사용하여 프로토콜을 보여줍니다.
그러나, 우리는 프로토콜이 다양한 동물 종에서 사용될 수 있다고 믿습니다. 웬타 리와 함께 절차를 시연하는 것은 우리 연구소의 임상의인 순성(Shun Theng)이 될 것입니다. 좌초된 세타산으로부터 AMG 분석을 위한 쌍 매칭 간 및 신장 조직을 수집하고, 조직을 24~48시간 동안 10%의 중성 완충 포르말린의 10배 부피로 고정하는 것으로 시작한다.
다음으로, 일회용 스테인리스 스틸 마이크로톤 블레이드를 사용하여 포르말린 고정 간 및 신장 조직을 1센티미터, 3mm 구간으로 2센티미터로 자르고 동일한 개인의 간과 신장 섹션을 동일한 라벨이 부착된 카세트에 배치합니다. 일련의 등급에 등급이 매겨진 에탄올과 자일렌 몰입을 통해 조직 프로세서의 섹션을 탈수하고 1 시간 2 시간 파라핀 몰입을 합니다. 2 시간 파라핀 침지 후, 조직을 강철 조직학 금형의 바닥으로 옮기고 탈수 된 조직 샘플을 신선한 녹은 파라핀으로 포함시킴을 포함시킴이 됩니다.
파라핀이 고화될 때까지 파랭판에 고정된 파라핀 내장 조직 블록을 차갑게 하고, 조직 표면이 노출될 때까지 마이크로토메에서 각 블록을 다듬습니다. 샘플을 영하 20도에서 10분간 식히고 마이크로톤에 5마이크로미터 의 조직 섹션을 가져옵니다. 핀셋과 브러쉬를 사용하여 조직 섹션의 리본을 획득할 때 들어 올리고 분리 될 때까지 섭씨 45도의 이중 증류 수조 표면에 띄우고 개별 현미경 슬라이드에 놓습니다.
그런 다음 슬라이드를 섭씨 60도에서 1시간 동안 미끄럼온에 놓습니다. 그런 다음 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓고 8-5 및 3 분 잠복식을 위해 순수 비 자일렌 200 ~250 밀리리터를 포함하는 세 가지 염색 요리에 섹션을 분리합니다. 등급에 매겨진 에탄올 용액의 다른 염색 접시에 탈 파라피화 샘플을 수분화한 다음 이중 증류수에서 헹구는 것입니다.
PBS에서 섹션을 한 번 헹구면 5% Triton X 100, PBS에서만 여러 번, 세척당 30초 동안 신선한 이중 증류수로 한 번 보충합니다. 마지막 세척 후 각 샘플을 300 마이크로리터의 혼합 은 개선 키트 솔루션으로 라벨을 부착하여 실온에서 어둠 속에서 15분 이상 라벨을 붙입니다. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 이중 증류수로 세척하고 슬라이드당 300 마이크로리터의 헤마톡시린을 10초 동안 반소 얼룩지게 합니다.
흐르는 수돗물로 슬라이드를 씻으십시오. 건조하고 장착 매체로 섹션을 장착합니다. 그런 다음, 각 조직 섹션의 10 무작위 조직 학적 이미지를 캡처, 빛 현미경의 40X 목표에 따라.
자동 메타알로그래피 또는 AMG를 분석하려면 시료의 긍정성, 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에서 이미지를 열고 이미지, 유형 및 RGB 스택을 선택하여 첫 번째 이미지를 빨간색, 파란색 및 녹색 색상 채널로 분할합니다. 블루 채널에서, 이미지를 선택, 조정 및 임계값, 각 이미지에서 AMG 양성 신호와 영역의 백분율을 측정, 수동으로 핵, 또는 적혈구에 거짓 양성 영역의 존재에 따라 각 이미지의 임계 값에 대한 컷오프 값을 조정. 분석을 클릭하고 측정을 설정하고 영역 분수를 확인하여 영역 분획이 기록됨을 지정합니다.
분석 및 측정을 클릭하여 결과 창의 각 조직학적 이미지 백분율 영역 열의 양수 백분율 영역 열을 표시합니다. 유도 결합된 플라즈마 질량 분광법과 AMG 양성 값 간의 상관 관계를 평가하려면 적절한 그래프 소프트웨어를 엽니다. 새 프로젝트 파일을 만들고 XY 및 상관 관계를 선택합니다.
유도 결합된 플라즈마 질량 분광법 및 AMG 분석의 결과를 입력하고, 분석 및 상관관계를 선택하여 Pearson 상관 관계 분석에 의한 분석 결과 간의 연관성 강도를 분석한다. 매개 변수에서 비선형 회귀 창에서 적합 페이지에서 다른 회귀 모델을 선택하고 비교 페이지에서 비교 방법을 선택합니다. 제곱 F 테스트의 추가 합계와 아카이케의 정보 기준을 포함합니다.
비교 방법의 결과에 따르면, 세타산 조직학적 은 분석에서 비교적 적합한 회귀 모델을 선택하고, 알 수 없는 은 농도를 가진 세타산 간 및 신장 조직의 은 농도를 추정하기 위해 분석법을 사용합니다. AMG 양성 신호는 간세포와 Kupffer 세포의 세포질에 있는 다양한 크기, 갈색에서 검은 과립을 포함하고, 몇몇 근위 신장 관의 루멘 및 지하실 막에 있는 갈색 AMG 양성 신호에 가끔 무정형, 황금 황색을 포함합니다. 분석된 간 및 신장 조직에서 교원결합 된 혈장 질량 분광법과 AMG 양성값의 결과 사이에는 긍정적인 상관관계가 있으며, 기원을 통한 바람직한 선형 회귀와 함께, 제곱 F 테스트의 추가 합계에 따라, 그리고 아카이케의 정보 기준.
이 절차를 시도하는 동안 AMG 방법은 보조 방법이며 ICPMS와 같은 다른 특정 방법과 함께 조직의 중금속 의 실제 구성을 모니터링하는 데 사용해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
