Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da toxicologia ambiental sobre distribuições de subsiúdicos e concentração de metais pesados dentro de sistemas biológicos. A principal vantagem dessa técnica é que a AMG é uma metodologia fácil de usar e barata, que é um valioso adjuvante para investigar metais pesados em tecidos. Usamos os tecidos de golfinhos e baleias para demonstrar o protocolo.
No entanto, acreditamos que o protocolo poderia ser usado em uma variedade de espécies animais. Demonstrando o procedimento com Wen-Ta Li será Shun Theng, um clínico do nosso instituto. Comece coletando tecidos hepáticos e renais pareados para análise de AMG a partir de um cetáceo encalhado, e fixando o tecido em 10 vezes o volume de formalina tamponada 10% neutra por 24 a 48 horas.
Em seguida, use lâminas descartáveis de microtome de aço inoxidável para aparar os tecidos hepáticos e renais fixados em dois centímetros por um centímetro, seções de três milímetros, e colocar seções de fígado e rins do mesmo indivíduo nas mesmas fitas rotuladas. Desidratar as seções em um processador de tecido através de uma série de imersões de etanol e xileno, seguidas por imersões de parafina de uma hora e duas horas. Após a imersão de duas horas de parafina, transfira os tecidos para os fundos dos moldes de histologia de aço e incorpore as amostras de tecido desidratado com parafina derretida fresca.
Esfrie os blocos de tecido fixos e embutidos em parafina em uma placa fria, até que a parafina se solidifique e corte cada bloco no microtome até que a superfície do tecido seja exposta. Esfrie as amostras a menos 20 graus Celsius por 10 minutos, e obtenha seções de tecido de cinco micrômetros no microtoma. Usando pinças e pincéis, levante as fitas da seção de tecido à medida que forem adquiridas, e flutue-as na superfície de um banho de água duplo Celsius de 45 graus Celsius, até que possam ser separados, e coloque em slides de microscópio individuais.
Em seguida, coloque os slides em um aquecedor de slides por uma hora, a 60 graus Celsius. Em seguida, coloque os slides em racks de slides e desofie as seções em três diferentes pratos de coloração contendo 200 a 250 mililitros de puro não-xileno para incubações de oito e cinco e três minutos. Hidrate as amostras des parrafinadas em diferentes pratos de coloração de soluções de etanol de grau, seguido por enxaguar em água duplamente destilada.
Enxágüe as seções uma vez em PBS suplementadas com 5%Triton X 100, várias vezes apenas em PBS, e uma vez em água fresca dupla-destilada por 30 segundos por lavagem. Após a última lavagem, rotule cada amostra com 300 microliters de solução de kit de aprimoramento de prata mista, por não mais do que 15 minutos no escuro à temperatura ambiente. No final da incubação, lave os slides com água duplamente destilada e contra-colorisse as seções em 300 microliters de hematoxilina por lâmina, por 10 segundos.
Lave os slides com água da torneira. Seque-os e monte as seções com meio de montagem. Em seguida, capture 10 imagens histológicas aleatórias de cada seção tecidual, sob o objetivo de 40X de um microscópio leve.
Para analisar a autometallografia, ou AMG, positividade das amostras, abra as imagens em um programa de software de análise de imagem apropriado e selecione imagem, tipo e pilha RGB, para dividir a primeira imagem nos canais vermelho, azul e verde. No canal azul, selecione imagem, ajuste e limiar, para medir a porcentagem da área com sinais AMG positivos em cada imagem, ajustando manualmente o valor de corte para o limiar de cada imagem com base na presença de áreas falso-positivas nos núcleos, ou glóbulos vermelhos. Clique em analisar e definir medidas e verificar a fração da área, para especificar se a fração da área está registrada.
Clique em analisar e medir, para exibir a área percentual positiva de cada coluna de porcentagem de imagem histológica da janela de resultado. Para avaliar a correlação entre os resultados da espectroscopia de massa plasmática indutivamente acoplado e os valores AMG-positivos, abra o software gráfico apropriado. Crie um novo arquivo de projeto e selecione XY e correlação.
Insira os resultados da espectroscopia de massa plasmática indutivamente acoplada e análises AMG, e selecione análises e correlação, para analisar a força de associação entre os resultados da análise da correlação de Pearson. Nos parâmetros, janela de regressão não linear, selecione um modelo de regressão diferente na página de ajuste e selecione os métodos de comparação na página de comparação. Inclua a soma extra dos quadrados teste F, e critério de informação de Akaike.
De acordo com os resultados dos métodos de comparação, selecione um modelo de regressão relativamente apropriado no ensaio de prata histológica cetáceo, e use o ensaio para estimar as concentrações de prata do fígado de cetáceos e tecidos renais, com concentrações de prata desconhecidas. Os sinais positivos da AMG incluem grânulos marrom a preto variados no citoplasma de hepatócitos e células kupffer, e sinais amorfos ocasionais, amarelo dourado a marrom AMG-positivos no lúmen e membrana do porão de alguns túbulos renais proximais. Há uma correlação positiva entre os resultados da espectroscopia de massa plasmática indutivamente acoplado e os valores de positividade AMG nos tecidos hepáticos e renais analisados, com uma regressão linear preferencial através da origem, de acordo com a soma extra do teste de quadrados F, e o Critério de Informação de Akaike.
Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que o método AMG é um método adjuvante, e deve ser usado com outros métodos específicos, como o ICPMS, para monitorar a composição real de metais pesados nos tecidos.
