Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Umwelttoxikologie über Suborganverteilungen und die Konzentration von Schwermetallen in biologischen Systemen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass AMG eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methodik ist, das ein wertvolles Adjuvans für die Untersuchung von Schwermetallen in Geweben ist. Wir verwenden das Gewebe von Delfinen und Walen, um das Protokoll zu demonstrieren.
Wir glauben jedoch, dass das Protokoll bei einer Vielzahl von Tierarten verwendet werden könnte. Demonstriert wird das Verfahren mit Wen-Ta Li, einem Arzt unseres Instituts. Beginnen Sie mit dem Sammeln von paarabgestimmten Leber- und Nierengewebefür die AMG-Analyse von einem gestrandeten Wal und fixieren Sie das Gewebe in 10-mal dem Volumen von 10% neutral gepuffertem Formalin für 24 bis 48 Stunden.
Als nächstes verwenden Sie Einweg-Mikrotomklingen aus Edelstahl, um das formal fixierte Leber- und Nierengewebe um einen Zentimeter, Drei-Millimeter-Abschnitte, in zwei Zentimeter zu trimmen und leber- und Nierenabschnitte desselben Individuums in die gleichen beschrifteten Kassetten zu legen. Dehydrieren Sie die Abschnitte in einem Gewebeprozessor durch eine Reihe von abgestuften Ethanol- und Xylol-Eintauchen, gefolgt von einstündigen und zweistündigen Paraffin-Eintauchen. Nach dem zweistündigen Paraffin-Eintauchen das Gewebe auf die Böden der Stahlhistologieformen übertragen und die dehydrierten Gewebeproben mit frisch geschmolzenem Paraffin einbetten.
Kühlen Sie die formalfixierten, paraffin-eingebetteten Gewebeblöcke auf einer kalten Platte, bis das Paraffin erstarrt, und trimmen Sie jeden Block am Mikrotome, bis die Gewebeoberfläche freigelegt ist. Kühlen Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius für 10 Minuten, und erhalten Sie fünf Mikrometer Gewebeabschnitte auf dem Mikrotom. Heben Sie die Bänder des Gewebeteils mit Einer Pinzette und Bürsten an, während sie erworben werden, und schweben Sie sie auf die Oberfläche eines 45 Grad Celsius doppeldestillierten Wasserbades, bis sie getrennt werden können, und legen Sie sie auf einzelne Mikroskopschlitten.
Dann legen Sie die Rutschen auf einem Diawärmer für eine Stunde, bei 60 Grad Celsius. Legen Sie dann die Dias in Diagestelle und deparaffinisieren Sie die Abschnitte in drei verschiedenen Färbeschalen, die 200 bis 250 Milliliter reines Nicht-Xylol für acht-fünf- und dreiminütige Inkubationen enthalten. Hydratisieren Sie die deparrafinisierten Proben in verschiedenen Färbeschalen von abgestuften Ethanollösungen, gefolgt von dem Spülen in doppelt destilliertem Wasser.
Spülen Sie die Abschnitte einmal in PBS, ergänzt mit 5%Triton X 100, mehrmals in PBS allein und einmal in frischem doppelt destilliertem Wasser für 30 Sekunden pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche jede Probe mit 300 Mikroliter n.A. gemischte silber Verbesserung Kit Lösung, für nicht mehr als 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Dias mit doppelt destilliertem Wasser waschen und die Abschnitte in 300 Mikroliter Hämatoxylin pro Schlitten 10 Sekunden lang gegenfärben.
Waschen Sie die Rutschen mit fließendem Leitungswasser. Trocknen Sie sie und montieren Sie die Abschnitte mit Montagemedium. Erfassen Sie dann 10 zufällige histologische Bilder von jedem Gewebeabschnitt unter dem 40-fachen Objektiv eines Lichtmikroskops.
Um die Positivität der Stichproben zu analysieren, oder AMG, öffnen Sie die Bilder in einem geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramm, und wählen Sie Bild, Typ und RGB-Stack aus, um das erste Bild in die roten, blauen und grünen Farbkanäle aufzuteilen. Wählen Sie im blauen Kanal Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, um den Prozentsatz der Fläche mit AMG-positiven Signalen in jedem Bild zu messen, wobei der Grenzwert für den Schwellenwert jedes Bildes manuell basierend auf dem Vorhandensein falsch-positiver Bereiche in den Kernen oder roten Blutkörperchen angepasst wird. Klicken Sie auf Analysieren, Festlegen von Messungen, und überprüfen Sie den Flächenanteil, um anzugeben, dass der Flächenanteil aufgezeichnet wird.
Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um den positiven Prozentbereich jeder histologischen Bildprozentbereichsspalte des Ergebnisfensters anzuzeigen. Um die Korrelation zwischen den Ergebnissen der induktiv gekoppelten Plasmamassenspektroskopie und AMG-positiven Werten zu bewerten, öffnen Sie die entsprechende Graphiksoftware. Erstellen Sie eine neue Projektdatei, und wählen Sie XY und Korrelation aus.
Geben Sie die Ergebnisse der induktiv gekoppelten Plasmamassenspektroskopie und AMG-Analysen ein, und wählen Sie Analyse und Korrelation aus, um die Stärke der Assoziation zwischen den Ergebnissen der Analyse durch Pearson-Korrelationsanalyse zu analysieren. Wählen Sie im nichtlinearen Regressionsfenster ein anderes Regressionsmodell auf der Anpassungsseite aus, und wählen Sie die Vergleichsmethoden auf der Vergleichsseite aus. Schließen Sie die zusätzliche Summe der Quadrate F-Test und Akaikes Informationskriterium ein.
Wählen Sie nach den Ergebnissen der Vergleichsmethoden ein relativ geeignetes Regressionsmodell im walesischen histologischen Silbertest aus und verwenden Sie den Assay, um die Silberkonzentrationen der Walleber und des Nierengewebes mit unbekannten Silberkonzentrationen zu schätzen. AMG-positive Signale sind variabel große, braune bis schwarze Granulate im Zytoplasma von Hepatozyten und Kupffer-Zellen sowie gelegentlich emorphe, goldgelbe bis braune AMG-positive Signale im Lumen und in der Kellermembran einiger proximaler Nierentubuli. Es besteht eine positive Korrelation zwischen den Ergebnissen der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektroskopie und AMG-Positivitätswerten im analysierten Leber- und Nierengewebe, mit einer bevorzugten linearen Regression durch den Ursprung, entsprechend der zusätzlichen Summe der Quadrate F-Test, und Akaikes Informationskriterium.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die AMG-Methode eine adjuvante Methode ist und mit anderen spezifischen Methoden wie ICPMS zur Überwachung der tatsächlichen Zusammensetzung von Schwermetallen in Geweben verwendet werden muss.
