Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicología ambiental sobre las distribuciones de suborgánicas y la concentración de metales pesados dentro de los sistemas biológicos. La principal ventaja de esta técnica es que AMG es una metodología fácil de usar y económica, que es un valioso adyuvante para investigar metales pesados en tejidos. Usamos los tejidos de delfines y ballenas para demostrar el protocolo.
Sin embargo, creemos que el protocolo podría ser utilizado en una variedad de especies animales. Demostrando el procedimiento con Wen-Ta Li será Shun Theng, un clínico de nuestro instituto. Comience por recoger los tejidos hepáticos y renales emparejados para el análisis de AMG de un cetáceo trenzado, y fijar el tejido en 10 veces el volumen de formalina tamponada 10% neutral durante 24 a 48 horas.
A continuación, utilice cuchillas desechables de microtoma de acero inoxidable para recortar los tejidos hepáticos y renales fijos en formalina en secciones de dos centímetros por un centímetro y tres milímetros, y coloque secciones hepáticas y renales del mismo individuo en los mismos casetes etiquetados. Deshidratar las secciones de un procesador de tejidos a través de una serie de inmersiones de etanol y xileno grados, seguidas de inmersiones de una hora y dos horas de parafina. Después de la inmersión de dos horas de parafina, transfiera los tejidos a los fondos de moldes histologías de acero e incruste las muestras de tejido deshidratado con parafina fresca derretida.
Enfríe los bloques de tejido fijados en formalina e incrustados en una placa fría, hasta que la parafina se solidifique, y recorte cada bloque en el microtoma hasta que la superficie del tejido quede expuesta. Enfríe las muestras a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos y obtenga secciones de tejido de cinco micrómetros en el microtoma. Usando pinzas y cepillos, levante las cintas de la sección de tejido a medida que se adquieren, y flote en la superficie de un baño de agua de doble destilación Celsius de 45 grados Celsius, hasta que se puedan separar, y colóquelos en diapositivas de microscopio individuales.
A continuación, coloque las diapositivas en un calentador de diapositivas durante una hora, a 60 grados centígrados. A continuación, coloque los portaobjetos en portaobjetos y des-parafinar las secciones en tres platos de tinción diferentes que contengan de 200 a 250 mililitros de puro no xileno para incubaciones de ocho y cinco minutos. Hidratar las muestras desoveladas en diferentes platos de tinción de soluciones de etanol preso, seguido de enjuagar en agua de doble destilación.
Enjuague las secciones una vez en PBS complementadas con 5%Triton X 100, varias veces solo en PBS, y una vez en agua fresca de doble destilación durante 30 segundos por lavado. Después del último lavado, etiquete cada muestra con 300 microlitros de solución de kit de mejora de plata mixta, durante no más de 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los portaobjetos con agua de doble destilación y contrataje las secciones en 300 microlitros de hematoxilina por tobogán, durante 10 segundos.
Lave los portaobjetos con agua corriente del grifo. Seque y monte las secciones con medio de montaje. A continuación, capture 10 imágenes histológicas aleatorias de cada sección de tejido, bajo el objetivo 40X de un microscopio de luz.
Para analizar la positividad de la autometallografía, o AMG, de las muestras, abra las imágenes en un programa de software de análisis de imágenes adecuado y seleccione la imagen, el tipo y la pila RGB para dividir la primera imagen en los canales de color rojo, azul y verde. En el canal azul, seleccione imagen, ajuste y umbral para medir el porcentaje del área con señales AMG positivas en cada imagen, ajustando manualmente el valor de corte para el umbral de cada imagen en función de la presencia de áreas falso-positivas en los núcleos, o glóbulos rojos. Haga clic en analizar y establecer medidas y compruebe la fracción de área para especificar que se registra la fracción de área.
Haga clic en analizar y medir para mostrar el área de porcentaje positivo de cada columna de área de porcentaje de imagen histológica de la ventana de resultados. Para evaluar la correlación entre los resultados de la espectroscopia de masa plasmática acoplada inductivamente y los valores positivos de AMG, abra el software gráfico adecuado. Cree un nuevo archivo de proyecto y seleccione XY y correlación.
Ingrese los resultados de la espectroscopia de masa plasmática acoplada inductivamente y los análisis AMG, y seleccione el análisis, y la correlación, para analizar la fuerza de asociación entre los resultados del análisis por el análisis de correlación de Pearson. En los parámetros, ventana de regresión no lineal, seleccione un modelo de regresión diferente en la página de ajuste y seleccione los métodos de comparación en la página de comparación. Incluya la suma adicional de la prueba F de los cuadrados y el Criterio de Información de Akaike.
De acuerdo con los resultados de los métodos de comparación, seleccione un modelo de regresión relativamente apropiado en el ensayo de plata histológica de cetáceos, y utilice el ensayo para estimar las concentraciones de plata del hígado cetáceo y los tejidos renales, con concentraciones de plata desconocidas. Las señales positivas de AMG incluyen gránulos de tamaño variable, de color marrón a negro en el citoplasma de hepatocitos y células Kupffer, y señales ocasionales de AMG AMG de color amarillo dorado a marrón en la membrana lumen y sótano de algunos túbulos renales proximales. Existe una correlación positiva entre los resultados de la espectroscopia de masa plasmática acoplada inductivamente y los valores de positividad AMG en los tejidos hepáticos y renales analizados, con una regresión lineal preferida a través del origen, de acuerdo con la suma adicional de la prueba F de cuadrados, y el Criterio de Información de Akaike.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el método AMG es un método adyuvante, y debe utilizarse con otro método específico, como ICPMS, para monitorear la composición real de metales pesados en los tejidos.
