この方法は、生体内の重金属のサブ器官分布と濃度に関する環境毒性学の分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、AMGが使いやすく安価な方法論であり、組織中の重金属を調査するための貴重なアジュバントであるということです。私たちは、プロトコルを実証するためにイルカやクジラからの組織を使用しています。
しかし、このプロトコルは様々な動物種に使用できると考えています。Wen-Ta Liとの手順を実証することは、私たちの研究所の臨床医であるShun Thengになります。まず、鎖でつながれた鯨類からAMG分析のためにペアマッチした肝臓と腎臓組織を収集し、24〜48時間の10%中性緩衝ホルマリンの体積の10倍の体積で組織を固定することから始めます。
次に、使い捨てステンレススチールのミクロトームブレードを使用して、ホルマリン固定肝臓と腎臓組織を1センチメートル、3ミリメートルの切片で2センチメートルにトリミングし、同じ個人の肝臓と腎臓の両方の切片を同じ標識カセットに入れる。一連のグレード付きエタノールとキシレン浸漬を通じて組織プロセッサのセクションを脱水し、続いて1時間と2時間のパラフィン浸漬を行います。2時間のパラフィン浸漬後、組織を鋼組織の鋳型の底に移し、脱水組織サンプルに新鮮な溶けたパラフィンを埋め込みます。
ホルマリン固定のパラフィン埋め込み組織ブロックを冷たいプレートに固めるまで冷やし、組織表面が露出するまでミクロトームで各ブロックをトリミングする。サンプルをマイナス20度で10分間冷やし、ミクロトーム上で5マイクロメートルの組織切片を得る。ピンセットとブラシを使用して、組織セクションのリボンを獲得時に持ち上げ、45°Cの二重蒸留水浴の表面に浮かべ、分離できるまで、個々の顕微鏡スライドに置きます。
その後、スライドをスライドウォーマーの上に1時間、摂氏60度で置きます。次に、スライドをスライドラックに入れ、8分と3分間のインキュベーションのために200〜250ミリリットルの純粋な非キシレンを含む3つの異なる染色皿でセクションを非パラフィン化します。脱パラフィン化されたサンプルを、等級エタノール溶液の異なる染色皿で水和し、続いて二重蒸留水ですすいだ。
5%トリトンX100を補うPBSでセクションを1回リンスし、PBS単独で数回、1回は洗浄ごとに30秒間新鮮な二重蒸留水で1回洗い流す。最後の洗浄後、各サンプルに300マイクロリットルの混合銀強化キット溶液をラベル付けし、室温で暗闇の中で15分以下にします。インキュベーションの最後に、二重蒸留水でスライドを洗浄し、1枚あたり300マイクロリットルのヘマトキシリンで10秒間セクションを反染色します。
水道水でスライドを洗います。それらを乾燥させ、取り付け媒体でセクションを取り付けます。次に、各組織部のランダムな組織学的画像を、光顕微鏡の40X目的の下で捕捉する。
サンプルのオートメタログラフィー(AMG)陽性を分析するには、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで画像を開き、画像、タイプ、RGB スタックを選択して、最初の画像を赤、青、緑のカラーチャンネルに分割します。青チャネルでは、画像を選択し、調整し、閾値を、各画像におけるAMG陽性信号を有する領域のパーセンテージを測定し、核内の偽陽性領域、または赤血球の存在に基づいて各画像の閾値のカットオフ値を手動で調整する。[解析]をクリックして、測定を設定し、面積の分数を確認して、面積の分数を記録するように指定します。
[解析]をクリックして測定し、結果ウィンドウの各組織学的画像パーセント領域列の正のパーセント領域を表示します。誘導結合プラズマ質量分析の結果とAMG陽性値の相関を評価するには、適切なグラフ作成ソフトウェアを開きます。新しいプロジェクト ファイルを作成し、[XY と関連付け] を選択します。
誘導結合プラズマ質量分析とAMG分析の結果を入力し、分析、および相関を選択し、ピアソン相関分析による解析結果間の関連の強さを分析する。パラメーターの非線形回帰ウィンドウで、適合ページで別の回帰モデルを選択し、比較ページで比較方法を選択します。F検定の余分な和と、アカイケの情報基準を含めます。
比較方法の結果に従って、鯨類組織の銀アッセイで比較的適切な回帰モデルを選択し、そのアッセイを用いて、未知の銀濃度を有する鯨類の肝臓および腎臓組織の銀濃度を推定する。AMG陽性シグナルには、肝細胞およびクファー細胞の細胞質における可変大きさの褐色から黒顆粒、および時折アモルファス、黄金色から茶色のAMG陽性シグナルが、いくつかの近位腎尿細管の内腔および地下膜に含まれる。分析された肝臓および腎臓組織における誘導結合血漿質量分析とAMG陽性値の結果と、原点を通じた線形回帰の好ましい線形回帰との間には、正の相関があり、F検定の余分な合計と、アカイケの情報基準に従う。
この手順を試みる間、AMG法はアジュバント法であり、組織中の重金属の実際の組成を監視するためにICPMSなどの他の特定の方法と一緒に使用する必要があることを覚えておくことが重要です。
