Мы благодарим Вирджиния Доэрти и Junmei Яо технической помощи. Это исследование было профинансировано (NiMH R01 MH084966), и армии Research Office США и обороны перспективных исследований Проекты агентства (грант W911NF-10-1-0059) к КАГ.

Все эксперименты проводились с использованием взрослых мужчин Лонг-Эванс крыс. Все процедуры проводились в соответствии с Национальными Институтами (NIH) Руководство здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных и были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных из Массачусетского технологического института и уходу и использованию животных рассмотрению Управлением по USAMRMC. 1. Подготовка <ol><li> Heparinise катетер и шприц, поместив экранированный иглу в 500 мкл пробирку, содержащую гепарин (1000 USP единиц / мл), а затем аспирации и вытесняя раствор гепарина через иглу. <ol><li> Приложите бабочка катетер шприца. Держать экран над иглой катетера, чтобы защитить острый кончик от повреждений. </li><li> Вывод объем гепарина, который немного больше, чем объем крови, которые будут собраны. Снять шприц и заполнить его с воздухом. </li><li> Повторно приложить шприц с катетером и использоватьвоздух выгнать излишки раствора гепарина; обеспечить только следовые количества остаются в насосно-компрессорных труб, иглы, и шприц. </li><li> Поместите стерильную катетер, со шприцем еще прикрепленным на стерильной поверхности. </li></ol></li><li> Быстро обеспечить крысу в чистую ткань, обеспечивая, что передних и hindpaws находятся в удобном положении и дыхание ограничений. <ol><li> Закрепите пленку с крючка и петли ленты; обеспечить, чтобы внешние половые органы не стягивается. </li><li> Попросите помощника осторожно и твердо сдерживать крысу (живот и основания хвоста) на твердой поверхности работы с хвостом висит от края прилавка. </li></ol></li></ol> 2. Кровь проб <ol><li> Погрузитесь хвост в 42 ° C воде в течение 40-50 сек расширять кровеносные сосуды и сухой хвост с бумажным полотенцем. Найдите в хвостовую вену, чтобы пустить кровь (повернуть все тело с хвостом, чтобы предотвратить скручивание хвост). Примечание: Достаточное потепление хвоста имеет решающее значение для быстрого Collectioп образце крови. Если сосудистая сжимается, правильное размещение катетера трудно, и поток крови значительно снижается. Грелку можно использовать в качестве альтернативы погружения в воду. </li><li> Определить точку отбора проб. Примечание: артерии лежит вдоль середины спинной части хвоста; не использовать это для отбора проб. <ol><li> Целевая либо левые и правые задние вены, которые находятся сбоку от артерии. Пигментация хвоста, которая зависит от штамма и увеличивается с возрастом, может скрывать некоторые из сосудов. Задача часть вены в нижней части хвоста. </li><li> Протрите целевую область с 2% раствором антисептика хлоргексидина. </li></ol></li><li> Создание отрицательное давление в шприце и катетера путем отвода плунжера от нуля до примерно 50 мкл. </li><li> Держите хвост мягко и твердо вблизи вершины, чтобы держать хвост прямо на протяжении отбора проб. Убедитесь, что поток крови не поглощается чрезмерно жесткий контроль.</li><li> Медленно вставьте катетер в вену под небольшим углом примерно 5 см от кончика хвоста. Когда вены проник, кровь будет течь в катетер. Медленно снять поршень шприца, чтобы собрать нужную громкость на постоянной скоростью (~ 20 мкл в секунду). <ol><li> Проконсультируйтесь с ветеринарным персонал для информации о максимальном объеме в крови, что может быть собрана. Максимальное количество крови, которые должны быть собраны, зависит от веса и состояния здоровья крысы. Не снимать более 15% от общего объема крови в течение 14 дней. Примечание: кровь гораздо сложнее собрать от животных, которые были остро подчеркнули в минут до сбора проб, потому что гормоны стресса сжимают сосудистую. Например, перемещение домой клетку крысы в ​​новую камеру, принимая несколько минут, чтобы обернуть животное, или повторное введение катетера в вену все, скорее всего, чтобы вызвать острую реакцию на стресс. </li><li> Содействие Blooд поток от &#39;&#39; доения вен. Запуск пальцем по длине вены, из базы в направлении кончика хвоста, но остаются более 2 см от кончика вставленной иглы или катетера может смещаться из вены. </li><li> Если кровь не может быть успешно собраны из исходного места проникновения катетера, повторно вставить иглу дальше в вену. Если кровь была собрана на начальном участке, вновь давление иглы, отсоединив и затем подсоединить катетер и шприц до повторной установки в вену. В общем, избежать дополнительных проходов. </li><li> Как несколько проникновений может вызвать крах в хвостовую вену, в которой кровоснабжение хвоста отрезать и мягкие ткани хвост становится некротической, усыпить крысу, если есть хвост коллапс вен. </li></ol></li><li> Когда адекватный объем выборки собирают, сбросьте давление в шприце, отключив и повторно катетер. Аспирируйте немного с помощью шприца (~ 50 &amp; #181; л), и вывести иглу из вены. Примечание: Если игла выведены без предварительного сброса давления в шприце, кровь будет капать из иглы. </li><li> Кратко оказать давление на месте введения, чтобы остановить кровотечение, и протрите раствором антисептика. Вернуться крысы его клетку. </li></ol> 3. Обработка образца крови <ol><li> Аспирируйте воздуха, чтобы обеспечить кровь не остается внутри катетера иглой, и использовать ножницы, чтобы вырезать трубки катетера чуть выше иглы. Выгнать кровь в стерильный 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Примечание: Если кровь проталкивается через иглу, усилие сдвига может вызвать эритроциты к разрыву, который может помешать многих последующих анализов. Снимите иглу, чтобы избежать гемолиза. <ol><li> Для сбора плазмы крови, использование труб, которые содержат ЭДТА в качестве антикоагулянта (здесь, использовать 10 мкл 0,1 М ЭДТА для 200-400 мкл крови, обеспечить концентрацию EDTA используется не мешает жIth вниз по течению анализа) и место на льду. <ol><li> Спин целые образцы крови при 2100 мкг в охлажденном центрифуге (4 ° C) в течение 10 мин в течение 10 мин сбора. Элюируют плазмы, избегая нарушения красные и белые слои клеток крови. </li></ol></li><li> Для сбора сыворотки крови, место образцов (без антикоагулянта) при комнатной температуре в течение до 30 мин для того, чтобы свертывание. Спин трубы сбора в охлажденном центрифуге (4 ° C) в 2000 х г. Затем может быть элюировали в сыворотке. </li></ol></li><li> Используйте образцы немедленно, или хранить при -80 ° С в течение до одного года. </li></ol>

<ol>
	<li>Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNAs+in+Patients+with+Acute+Myocardial+Infarction.">Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction.</a> Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).</li><li>Shah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Polyps:+Systematic+Review.">Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).</li><li>Chan, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+blood-based+protein+biomarker+strategies+in+the+study+of+psychiatric+disorders.">Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders.</a> Prog Neurobiol. , (2014).</li><li>Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+induces+learning+impairment+that+is+mediated+by+interleukin+1beta+in+rodents.">Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents.</a> PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).</li><li>Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+impairment+of+acquisition+of+a+spatial+memory+task+following+isoflurane-nitrous+oxide+anesthesia+in+rats.">Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats.</a> Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).</li><li>Vahl, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+ACTH+and+corticosterone+sampling+methods+in+rats.">Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).</li><li>Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+rats+with+various+behavioral+characteristics+during+acute+emotional+stress.">Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress.</a> Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).</li><li>McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+stress+hormones+in+health+and+disease:+Understanding+the+protective+and+damaging+effects+of+stress+and+stress+mediators.">Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators.</a> Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).</li><li>Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+norepinephrine+and+epinephrine+concentrations+in+adrenal+gland+of+the+rats+submitted+to+acute+immobilization+stress.">Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress.</a> Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).</li><li>Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ghrelin-growth+hormone+axis+drives+stress-induced+vulnerability+to+enhanced+fear.">A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear.</a> Mol Psychiatry. , (2013).</li><li>Knoll, A. T., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynorphin,+stress,+and+depression.">Dynorphin, stress, and depression.</a> Brain Res. 1314 (56-73), (2010).</li><li>Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical/hippocampal+monoamines,+HPA-axis+changes+and+aversive+behavior+following+stress+and+restress+in+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder.">Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder.</a> Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Здесь мы описываем быстрый и простой процедуры для получения образца крови от крыс, которые предлагает значительные преимущества по сравнению с другими широко используемыми методами. Во-первых, оно не требует анестезии, в отличие от выборки из яремной вены или заглазничными синуса. При образцы крови собирали окружающих поведенческие процедуры, введение анестетиков является нежелательным, поскольку это может помешать обучения и памяти 4,5. Во-вторых, это дает возможность собирать большие объемы крови, чем другие методы вены руки, например, коллекции из подкожных или спинной педали вен. Используя методику, описанную здесь, до 1,5 мл крови может быть собрана из крыс в одной точке времени, объем которого легко позволяет нескольким анализы, чтобы быть работать параллельно. Наконец, эта процедура сводит к минимуму возможность повреждения тканей по сравнению с кончика хвоста ампутации или ретроорбитального кровотечения. Использование этой процедуры способствует соблюдение животных WЗакон elfare и Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, которые требуют минимизации боли и страдания, которые являются результатом лабораторных процедур, выполняемых на животных. Рекомендуется, что следователи новые этому методу практикуют методы удержания и хвост кровотечение, чтобы минимизировать время, что экспериментальные животные сдержанный. Кровь собирали в менее чем 3 мин от начала ограничения обеспечивает оптимальные результаты. Протокол, описанный здесь, может быть использован для отбора проб от 1 до 4 раз в неделю, но не более двух раз в день. Хотя повторяющиеся коллекции крови могут быть выполнены различные участки отбора проб двигаться вверх от основания хвоста должны быть использованы, и левый и правый хвостовой вены следует чередовать в местах отбора проб. Общий объем крови грызунов 6-7% от их веса тела, и не более 15% от общего объема крови не должны быть собраны в течение 2-недельного периода. Сывороткаили плазма содержит приблизительно 40-60% от собранного объема образца. Забор крови с помощью боковых хвостовых вен может быть также выполнен в мыши, как описано здесь, с небольшими изменениями. Во-первых, можно использовать только небольшое калибровочные (27 г) катетеры. Во-вторых, рекомендуется использовать трубки фиксатор, а не пленкой, для иммобилизации мышей. Объем крови, которые могут быть получены от мыши с помощью венепункции подчелюстной сосудистого пучка (200-500 мкл) больше, чем может быть безопасно собраны из хвостовой вены (200 мкл максимум). Потому что забор крови из подчелюстной сосудистого пучка требуется минимальное сдержанность и может дать больше крови, это предпочтительный путь для отбора проб на мышах. Быстрота, с которой эта процедура может быть выполнена, вместе с минимально инвазивной природы, а также сводит к минимуму потенциальную возмущение мер кровь основана острой реакции на стресс 6.острый ответ напряжения может изменить циркулирующие уровни многих молекул, в том числе интерлейкинов и других иммунных активных факторов 7, гормонов гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси 8, гормонов в симпатической нервной системе, 9 грелина 10, эндогенных опиоидов 11, дофамина, и серотонина 12. Если покоящиеся циркулирующих меры этих молекул или других регулируемых этими молекулами желательно, важно, чтобы свести к минимуму реакцию на стресс, который срабатывает в течение всего лишь одной минуты от начала экспозиции стрессора. Ответные реакции на стресс не только изменить состав крови, но и представлять собой техническую препятствие для забора крови из-за сужения сосудов за счет увеличения приводом от симпатической нервной системы. Это становится повышение трудно получить устойчивый поток крови от крыс, которые монтажа острый стресс-ответа. Таким образом, бедствия животного должен быть минимциализированных для того, чтобы быстро получить образцы, которые отражают физиологическое состояние интереса.

Биомаркеров, полученные из крови предоставить полезную диагностическую, можно предсказать, и стратификации меры во многих клинических ситуациях, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, рака 1 2 наук и психиатрической болезни 3. Они также могут быть использованы в фундаментальной науке, чтобы оценить «состояние» организма, в том числе от степени голода, воспаления, или стресс настоящее время. Такие меры могут быть под влиянием переменных, которые могут или не могут иметь решающее значение для вопроса о процентах, в том числе от времени суток, что получается образец и пола испытуемых. Он также может быть под влиянием стресса, вызванного во время процедур отбора проб крови сам. Гормоны стресса и восприятие боли может быстро изменить состав крови. Грызуны являются наиболее широко используемым лабораторным животным, а несколько методов были разработаны для сбора крови. Идеальный метод отбора проб крови должны иметь минимальную physiologicaл воздействие на животных, не требуют анестезии, позволяют быстро и повторный отбор, и обеспечить достаточный объем крови для многочисленных последующих применений. Популярные методы для сбора крови, таких как катетеризации яремной вены или кончика хвоста ампутации не отвечают этим критериям. Целью данного протокола является описание методики отбора проб крови для использования у крыс, которые минимально стресс, не требует анестезии, позволяет несколько сборников крови в течение одного субъекта, и обеспечивает относительно большой объем пробы таким образом, что несколько анализы могут быть выполнены на одном образце. Цель этого метода является получение образцов крови, которые минимально влиянием острой реакции на стресс.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium heparin (1000 USP units/ml)</td>
			<td>Patternson Veterinary Supply</td>
			<td>25021040010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>JT Taylor</td>
			<td>JT2020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermachlor Rinse-Chlorhexadine</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>6356</td>
			<td>Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>TESV25BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin 1cc syringes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BD309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89202-682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#956;l microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>21150-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, stainless steel, 5&#34;</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml plastic beaker</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>414004-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean cloth wrap</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Velcro tape, .75&#34; width</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>B004AF9II6</td>
			<td>Hook and loop tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling blood from the lateral tail vein of the rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Плазма крови собирали из хвостовой вены боковой, как описано в протоколе дает образец плазмы, который был прозрачным и бледно-желтый внешний вид. Как показано на рисунке 1, гемолиз в пробе придает красноватый оттенок в плазме. Острая реакция на стресс может быстро изменить состав крови. Например, концентрация циркулирующего кортикостерона может заметно увеличить течение 10 мин воздействия стрессора, как показано на рисунке 2. Низкие базальные уровни кортикостерона, полученные с помощью этого метода до стрессора воздействия показывают, что сама процедура отбора проб не является существенным источником стресса. <img alt="Фигура 1" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Пример внешний вид (А) гемолизу образец показал. После центрифугирования плазмы или сыворотки слой (поверхность обозначено черным ARстрока) появится с оттенком розового или красного цвета. Более темные оттенки указывают на более высокий уровень гемолиза. (B) После центрифугирования, собранной за образец будет иметь четкое впечатление, желтовато к верхней полосе (поверхности, указанной черной стрелкой), что соответствует без гемолиза плазме или сыворотке. При удалении этот слой, важно, чтобы не нарушать основной цельной крови, либо путем нажатия пипетки в целом слоя крови или путем аспирации некоторые из цельной крови в наконечник. Любая плазма или сыворотка загрязнены цельной крови должны быть отброшены. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig2.jpg" /> Рисунок 2: Плазма кортикостерона быстро повышается после стрессовой ситуации кровь получали от боковой хвостовой вены у взрослых самок крыс Long-Evans до и 10 минут после воздействия 4 тонов (10 сек, 2 кГц, 85 дБ) со-терминатор. с Footshocks (1 сек, 350 мкА). Плазма крови кортикостерона в исходном (290,4 ± 138,8 пг / мл) был значительно меньше, чем уровни наблюдались следующие 10 мин презентации Footshock стресса (2204,8 ± 454,5 пг / мл, р = 0,02, N = 4), как определено с помощью парного T -test. * Р &lt;0,05

Watch this Scientific Journal Video about Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat at JoVE.com

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Забор крови из боковой хвостовой вены крыс

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

sampling-blood-from-the-lateral-tail-vein-of-the-rat

Research

JoVE Journal

Biology

101.9K Views.  Massachusetts Institute of Technology. Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Video: Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

Взятии крови у крыс путем подкожной вены и пункции сердца

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Микро-рассечение мозга крысы для РНК или белка Извлечение из конкретного региона мозга

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Обогащение NK клетки из человеческой крови Kit RosetteSep от StemCell Технологии

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Забор крови из американского Подкова Краб, Limulus Полифема

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Подготовка сухожилия крысиного хвоста для Биомеханические и Mechanobiological исследований

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Выделение и культуре эндотелиальных клеток легочной от новорожденных мышей

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Количественная Single микрососудов проницаемость в изолированном крови-перфузии Rat Подготовка легких

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Номера для терминалов методы проб крови у морских свинок

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Эффективное плюрипотентных клеток поколения от крови Использование эписом и HDAC ингибиторов

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for detecting the successful establishment of blood chimerism in parabionts by a caudal vein injection of glucose. Parabiotic mice were constructed. Glucose was injected into the donor mouse through the tail vein, and the fluctuation of blood glucose level was measured in both mice using a blood glucometer at different time points. Our results showed that after glucose injection, the blood glucose level in donor mice increased sharply after 1 min and decreased slowly thereafter. Meanwhile, the blood glucose level of the recipient mice peaked 15 min after injection. Similar results were obtained with Evans blue, used as a positive control for glucose. The synchronous fluctuation of blood glucose levels indicates that blood flow between the two mice was established successfully.

Here we describe a new method of detecting successful establishment of shared blood circulation of two parabionts through a caudal vein injection of glucose, which causes minimal damage and is not fatal to the parabionts.

Обнаружение создания общего кровоснабжения у парабиотических мышей путем инъекции глюкозы Caudal Vein

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...