Родопсин неправильное сфоливания вызывает прогрессирующую дегенерацию сетчатки называется пигментный ретинит. В то время как традиционный метод визуализации имеет ограниченные возможности для количественной оценки транспортировки родопсинов, этот недавно разработанный анализ на основе изображений позволяет проводить скрининг высокой пропускной способности, устраняя ложные срабатывания. Этот метод позволяет быстро оценки лекарственных препаратов фармакодинамики.
В глазах спасения складывания болезнетворного родопсин, тем самым ускоряя потенциал для лечения спокойно неизлечимой и ослепляющей болезни, пигментного ретинита. Клеточная локализация мембранного белка очень важна для его функции. Этот метод может быть легко изменен и применен для количественной оценки транспортировки любого другого мембранного белка, представляющих интерес.
Убедитесь, что вы подготовить карту пластины и аккуратно добавить и аспирировать жидкость из каждого колодец пластины, чтобы сохранить номер клетки и условия иммуно состояния последовательной между клетками. Это даст высокий коэффициент q и надежные результаты. Для начала, семена 5000 клеток на колодец в черный стеной, ясное дно, поли лизин лечение 384-хорошо пластины.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию с пятью процентами CO2 в течение трех часов для клеток, чтобы прикрепить к нижней части пластины. Далее, используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 10 микролитров на колодец 5X рабочих решений, в соответствии с заранее определены пластины карты, как показано здесь. Теперь добавьте 10 микролитров на колодец 2%DMSO к столбцам 22 и 24.
Кроме того, добавьте 10 микролитров на колодец из 25 микромолейных 9-цис-сетчатки к колонке 23 в темной комнате под тусклым красным светом. Когда закончите загрузку всех различных тестовых соединений, накройте пластину алюминиевой фольгой, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. Вынюхив 384-хорошо пластины в темной комнате с тусклым красным светом.
Здесь, используя 8-канал-аспиратор, подключенный к бутылке вакуумной коллекции, чтобы нежно аспирировать среду из колодцев пластины. Затем используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 20 микролитров на колодец свежеприготовленного 4%Paraformaldehyde ко всему 384-хорошо пластины, и исправить клетки в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации поместите пластину в нормальный свет.
Там, используйте 8-канал-аспиратор, чтобы аспирировать Paraformaldehyde в каждой хорошо, и использовать многоканальный пипетку, чтобы добавить 50 микролитров на колодец PBS. Аспирировать и заменить PBS в общей сложности три цикла мытья. Затем добавьте 20 микролитров на колодец сыворотки из 5%goat к каждому колодец, и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут.
После инкубации, аспирировать скважины, и добавить 15 микролитров 20 микрограммов на миллилитр B630 анти-родопсин антитела, в 1%goat сыворотки к скважинам в ряды A к O.Next, добавить 15 микролитров на скважину 1%goat сыворотки грести P для вторичного антитела только контрольной группы. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 90 минут, или при четырех градусах по Цельсию в течение ночи. Затем накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы избежать фотоотравливания флюорофоров.
Далее, мыть пластину три раза с 50 микролитров на колодец PBS. После последней стирки, аспирировать PBS, и добавить 15 микролитров на колодец из пяти микрограмм на миллилитр Cy3-спряженных коза анти-мышь IgG антитела. Обложка пластины с алюминиевой фольгой, и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение одного часа.
После инкубации трижды вымойте тарелку. Затем добавьте 50 микролитров на колодец PBS, содержащий один микрограмм на миллилитр пятна Hoechst при комнатной температуре в течение 15 минут. Наконец, запечатать хорошо пластины с прозрачной пленкой, покрыть его алюминиевой фольгой, и хранить при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели.
Снимите фольгу и поместите образец пластины в изображение высокого содержания, с A1 расположен в левом верхнем углу пластины. Далее откройте программное обеспечение для получения изображений для настройки параметров для получения изображений. Откройте окно установки приобретения пластины и создайте новую настройку или загрузите существующий файл настройки.
Выберите цель 20X и навейте киннинг пикселей как два, поэтому калиброванный размер пикселя составляет 0,80 на 0,80 микрона. Затем установите линии сканирования как 2000, и размер изображения как 1000 на 1000 пикселей на сайт. Далее выберите тип пластины для изображения.
Используйте информацию, предоставленную производителем, чтобы заполнить размеры пластины. Теперь выберите скважины, которые будут изображены вместе с четырьмя участками, которые будут изображены на скважину. Избегайте стороны колодеца, которые тронуты аспирации советы.
Для визуализации выберите лазеры возбуждения в качестве 405, 488 и 461 нанометров. Затем выберите фильтры выбросов для каналов DAPI, FITC и Texas Red. Оптимизируйте мощность лазера и выгоды каждого канала, чтобы обеспечить, чтобы скважины положительного контроля не были насыщены.
Выберите хорошо, чтобы хорошо сосредоточиться на автофокусировки. Затем выберите начальный колодец, который будет приобретен, и установите автофокус сайта для всех сайтов. Кроме того, выберите четыре средних значения на строку для каждого канала и оптимизируйте значение для каждого канала.
Подтвердите, что все правильно настроено, сначала проверяя две-три скважины по углам пластины, чтобы убедиться, что изображения находятся в центре внимания для всех проверенных скважин. Далее, проверьте, что изображения со всех сайтов на колодец имеют ячейки с более чем 40% слияния. Наконец, убедитесь, что флуоресцентная накаливость во всех каналах примерно наполовину насыщена 100%-ным контролем скважин.
Затем сохраните метод получения изображения и запустите всю пластину. Следите за изображением до тех пор, пока он не закончит захват изображений из первой колонны пластины, чтобы перепроверить качество изображения, прежде чем покинуть изображение. После завершения, удалить пластину и хранить его на четыре градуса по Цельсию для использования в будущем.
Вытяните данные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений с высоким содержанием. Выберите одну из 100%-контрольных скважин в столбце 23 для настройки параметров. Во-первых, выберите многоволновый сотовый скоринг в качестве метода анализа и начните настраивать дополнительные настройки.
Определите ядра с помощью изображений из канала DAPI. Предварительный просмотр, чтобы убедиться, что определенные формы ядер в выбранном хорошо вписывается в изображения ядер. Далее определите форму клетки в канале FITC, где изображен Родопсин Венера.
Для этого на настройке установлены минимальные и максимальные диаметры каждой клетки, минимальная интенсивность флуоресценции выше фона, а также минимальная площадь каждой клетки. Теперь определите области пятна поверхности родопсиновых клеток в Техасском Красном канале, установив минимальные и максимальные диаметры формы клеток, интенсивность флуоресценции мимиума над фоном, а также минимальную площадь каждой окрашенной клетки. Проверьте текущий алгоритм в пяти скважинах, чтобы определить, оптимизированы ли настройки.
Затем сохраните настройки и закройте окно конфигурации. Запустите все скважины с помощью оптимизированного метода анализа. После завершения экспорта номер объекта в качестве нетронутого номера ячейки.
Экспорт средней интенсивности канала FITC, как интенсивность родопсин Венеры, и экспортировать среднюю интенсивность Техасского Красного канала, как интенсивность родопсинов на поверхности клетки. Используйте программное обеспечение электронной таблицы для создания двухцветной тепловой карты для каждого параметра. Упорядочить название клеточных линий на х-оси, и соединения на оси.
Здесь наши изображения P23H родопсин Венера лечение U2OS клеток, выражая Венера флуоресценции в зеленом, и клеточной поверхности иммуно-окрашивания в красном цвете. Клетки либо лечились с помощью DMSO, либо с пятью микромоларами 9-cis-retinal. Анализ родопсинового транспорта, сравнивая количество родопсинов во всей клетке при различных условиях, показывает значительное восстановление в линии клеток-мутантов P23H, при лечении 9-цис-сетчаткой.
Кроме того, интенсивность родоппина на поверхности клетки, а также соотношение пятна родопсинов на поверхности клетки к интенсивности родопсин Венеры во всей клетке, не значительно ниже для мутанта P23H, по сравнению с дикорастученым родопсином, обработанным DMSO. Тепловая карта является эффективным способом сравнения среднего количества родопсинов и локализации на ячейку в нескольких мутантах. Здесь элементы управления дикимитипами и шесть родопсин-мутантов перечислены горизонтально, а эффекты сложных методов лечения сравниваются вертикально.
В согласии с предыдущими исследованиями интенсивность родопсинов на поверхности клетки и соотношение пятна родопцина на поверхности клетки к интенсивности родопсин Венеры ниже для шести мутантов по сравнению с диким типом, обработанным DMSO. Соединения один, два, шесть и девять значительно увеличили соотношение пятна родопцина на поверхности клетки к интенсивности родопсин Венеры в T4R, P23H, D190N, и P267L родопсин мутантов, предполагая, что эти соединения спасти транспортировку этих родопсин мутантов в плазменной мембране. Имейте в виду, что клетки должны быть между 50 и 70% стечения перед фиксацией, так как это имеет решающее значение для анализа изображений.
Кроме того, мы показали изображения колодцев по всей тарелке. Убедитесь, что изображения в фокусе, и что флуоресценция, которые не выходят, имеют все пороговое значение для любого канала. В до выбора соединений, которые спасают неправильно сфоленый родопсин транспорта, мы можем проверить процесс, а затем передать эффективность этих соединений in vivo, используя мышь-модель, выражают родопсин P23H мутант.
Этот метод позволяет количественно оценить количество мембранного белка и его локализацию. Таким образом, это отличный инструмент для микро ошибка началась на мембранный белок на помощь сохранить и деградации. Параформальдегид, как и в этом эксперименте, имеет процедуры, связанные с обработкой этого реагента.
Это будет сделано под капотом. Отходы, включая этот реагент, должны быть надлежащим образом утилизированы в качестве опасного химического вещества.
