Сообщалось о прямом перепрограммировании для генерации меланоцитов. Тем не менее, различные факторы транскрипции используются в разных исследованиях. В этом протоколе мы проверили и уменьшили число факторов транскрипции еще с более высокой эффективностью перепрограммирования.
Мы создали систему прямого перепрограммирования для генерации меланоцитов, используя только три фактора транскрипции, Mitf, Sox10 и PAX3, и модифицировали систему культивирования, чтобы сделать ее более стабильной и надежной. Как регенерировать функциональные меланоциты является важным вопросом, который может помочь устранить ограничения терапии для депигментационных заболеваний, таких как витилиго. Правильное перепрограммирование обеспечивает перспективу Наша техника обладает характеристиками удобства, сильной работоспособности и стабильности, которые легче продвигать и повторять.
Чтобы начать производство концентрированного лентивируса, вводят 1,5 раза 10 по 6 heK-293T клеток в 60-миллиметровую чашку и культивируют клетки с нормальной средой при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом. После 24 часов инкубации, когда клетки HEK-293T достигнут 80-90% конфюлюзии, замените среду 3,5 мл DMEM, затем инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение двух часов. После удаления клеток из инкубатора замените среду DMEM, содержащую 2% FBS, и добавьте свежеприготовленную смесь трансфекционного комплекса в клетки по каплям.
Аккуратно перемешайте жидкую смесь. По завершении восьми часов измените клеточную среду на 3,5 мл нормальной среды. Соберите супернатант вируса в 24 и 48 часов.
Затем смешайте вирусные супернатанты, собранные в двух разных временных точках, и центрифугируйте смесь при 200 xg в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем пропустите собранный супернатант через 0,45-микронные фильтры для сбора фильтрата в 50-мл стерильную коническую трубку. Концентрируйте фильтрованный вирусный супернатант центрифугированием при 6 000 хг при четырех градусах Цельсия в течение ночи.
После этого убедитесь, что гранула вируса видна в нижней части конической трубки. Выливайте супернатант медленно. Для растворения гранул вируса в нормальной среде с одним на 100*объемом супернатанта вируса.
Используйте микропипетку P1000, чтобы аккуратно пипетку вверх и вниз до получения однородной 100-кратной концентрированной вирусной смеси. Разделите концентрированный вирус на микроцентрифужные трубки для хранения при температуре 80 градусов цельсия. Плита 1 раз по 10 до 5-й ячейки HEK-293T в одну скважину из шестилуночной пластины.
Культивируйте эти клетки с нормальной средой при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом. Через 24 часа добавьте от 0,1 до 0,2 микролитра 100-кратного флуоресцентного концентрированного вируса в каждую лунку. С последующим добавлением четырех нанограммов на микролитр катионного полимерного трансфекционного реагента к каждой лунке.
Примерно через восемь-двенадцать часов после заражения вирусом замените среду нормальной средой. Через сорок восемь часов после заражения вымойте посуду 1 мл стерильного PBS, чтобы удалить мертвые клетки. Затем трипсинизируют клетки, используя 250 микролитров 0,05% раствора трипсина-ЭДТА на лунку шестилуночной пластины при комнатной температуре.
Центрифугируйте пластину при 200 хг в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта повторно суспендируйте ячейку гранулы в одном мл PBS и добавьте клеточную суспензию в трубку с круглым дном из полистирола в пять мл. Затем поместите трубку в проточный цитометр для анализа образца.
Для прямого перепрограммирования фибробластов покрывают одну лунку шестилуночной клеточной культуральной пластины 1 мл 0,1% раствора желатина при комнатной температуре. Через 15 - 30 минут, когда лунка будет полностью покрыта желатином, аспират 0,1% раствор желатина. Затем 5 раз по 10 до 4-й мышиные эмбриональные фибробласты, или MEF, помещают в одну лунку из шестилуночной пластины, покрытой 0,1% желатина, и культивируют клетки в течение ночи с нормальной средой при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом.
Через 24 часа, когда MEF достигнут слияния от 40 до 50%, замените среду нормальной средой. Далее растопить замороженный, концентрированный вирус на льду. Рассчитайте объем вируса, который будет добавлен с помощью уравнения, а затем добавьте концентрированный вирус для шести факторов транскрипции в каждую скважину в соответствии с рассчитанным объемом.
Добавьте четыре микрограмма на мл катионного полимерного трансфекционного агента в лунку. Рассмотрим его как нулевой день лентивирусной инфекции. В первый день, после 8-12 часов инфекции, замените среду, содержащую вирус, свежей нормальной средой, добавляя 0,5 микрограмма на мл пуромицина для скрининга стабильных инфицированных клеточных линий.
На второй день, через 48 часов после заражения, постепенно заменяйте надводную среду перепрограммирующей средой. Измените одну четверть от общего объема среды, прежде чем добавлять три микромоляра CHIR99021. С третьего по седьмой день, в зависимости от состояния клеток, изменяйте среду, постепенно заменяя ее более высокой долей перепрограммирующей среды, чтобы переключиться на полную среду перепрограммирования в течение пяти дней.
Далее отделяют клетки 500 микролитрами 0,05% трипсина-ЭДТА пищеварительного фермента на три минуты при комнатной температуре. Когда примерно шестьдесят процентов клеток всплывут вверх, остановите пищеварение, добавив нормальную среду, в два раза превышающую объем пищеварительного фермента. Соберите клеточную суспензию в 15-мл стерильную коническую трубку для центрифуги при 200 хг в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Удалите супернатант перед повторной приостановкой клеточной гранулы с помощью среды перепрограммирования. Когда это будет сделано, обложите повторно взвешенные клетки в 60-миллиметровую стерильную посуду. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном 5%-ном инкубаторе углекислого газа.
После сорока восьми часов лентивирусной инфекции в клетках HEK-293T успех концентрированной продукции лентивируса оценивали путем наблюдения за интенсивностью флуоресценции GFP или с помощью проточной цитометрии. Было обнаружено, что титр концентрированного вируса высок при 10-8-м TU/мл. Во время прямого перепрограммирования фибробластов морфология клеток постепенно изменялась на удлиненный клеточный синапс и увеличенные клеточные ядра.
Однако клетки постепенно стареют после двадцати дней. Удаление факторов транскрипции, Mitf, Pax3 или Sox10, привело к заглушанию экспрессии меланоцитарных генов, Tyr, Tyrp1 и Mlana, что указывает на наибольшее влияние на превращение фибробластов в меланоциты. Следовательно, экспрессия меланоцитарных генов, индуцированных прямым программированием с тремя факторами транскрипции, была выше по сравнению с шестью факторами транскрипции.
Для идентификации MEF-индуцированных меланоцитов, или iMels, экспрессия меланоцитарных маркеров, TYRP1 и DCT была обнаружена с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания. Кроме того, меланин-специфические методы окрашивания, такие как DOPA и окрашивание Массона-Фонтана, показали положительные результаты. Ячейки 293T должны быть распределены равномерно.
Кроме того, добавление трансфекционной смеси к клеткам должно быть сделано осторожно, чтобы предотвратить плавание клеток. Протокол является стабильным и практичным, и его можно использовать для перепрограммирования других типов клеток. Ожидается, что он обеспечит ориентир и стратегию прямого перепрограммирования in vivo в регенерации меланоцитов в будущей медицине.
