Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной и клеточной биологии, такие как выявление гомологичные события рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках мыши. Основным преимуществом этой техники является то, что она точна, надежна и широко используется. Таким образом, этот метод может дать представление о выявлении гомологичные события рекомбинации в эмбриональной стволовой клетке мыши.
Он также может быть применен к другим системам, таким как генетически модифицированные клетки или животные. Как правило, отдельные новые для этого метода будет бороться, потому что это занимает много времени и включает в себя несколько шагов. Для каждого gDNA, смешать 30 микролитров 10 х буфера для DRA один, три микролитров DRA один и 10 микрограммов gDNAs на образец.
Добавить воду до конечного объема 30 микролитров, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь, чтобы переварить gDNAs. Приготовьте 1%agarose электрофорез гель с бромистого этидия. Загрузите ранее приобретенные образцы вместе с одной лестницей КБ на гель, и запустите его на 30 до 40 вольт в одночасье.
На следующий день замочите гель в подносе, содержащем раствор соляной кислоты 0,2 ньютона. Используйте шейкер, чтобы встряхнуть лоток осторожно в течение 20 минут при комнатной температуре. Перенесите гель в лоток, содержащий раствор денатурации ДНК.
Встряхните его осторожно в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем перенесите гель в лоток, содержащий нейтрализующий раствор ДНК. И встряхните его осторожно в течение 20 минут при комнатной температуре.
Используя систему быстрой передачи вниз, перенесите ДНК из геля в мембрану. Далее, собрать turble blotter и blotting стек, как указано в инструкциях, предоставленных производителем. После этого вынул мембрану и мыть его с двумя X солевой цитрат натрия в течение одной минуты.
Усваивать жидкость с тканями, а затем использовать УФ-кросслинкер, чтобы пересечь связь ДНК с мембраной. Чтобы начать маркировку ДНК зондов с радиоактивностью, добавить тепло денатурированных зонд ДНК в трубку, содержащую готовы пойти ДНК маркировки бисера. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать.
И добавить пять микролитров радиоактивно помечены дезоксицитодин трифосфата. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Очистите помеченные зонды с помощью микроконсурсов G 50 в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем.
Используйте счетчик сцинтилляции для измерения радиоактивности. Чтобы начать гибридизацию мембран с помеченными зондами, поместите мембрану в трубу гибридизации. Добавьте смешанное предварительное решение для гибридизации.
Поместите трубку в духовку гибридизации и дайте предварительной гибридизации продолжить при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Затем вынюйте трубку из духовки и вылейте предварительно гибридизациорный раствор в 50-миллилитровую трубку. Добавить денатурированный зонд и аккуратно перемешать.
Чтобы удалить не гибридизированные зонды, поместите мембрану в лоток, содержащий один X солевой цитрат натрия с 0,1%SDS и осторожно встряхнуть при 55 до 60 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После этого оберните мембрану полиэтиленовой пленкой и зафиксните ее в кассете экспозиции. В темной комнате подвергайте мембрану двум листам рентгеновской пленки.
Разработайте пленку, чтобы визуализировать результаты. Определите, является ли соответствующий клон ES желаемым с целью рекомбинации или нет, в зависимости от размеров полос ДНК, обнаруженных зондами. В этом исследовании, южные blotting и ПЦР используется для выявления HR событий, которые происходят в клетках мыши ES для генерации NM две генетические модели мыши замены с использованием ES-клеток на основе HR опосредовано ориентации технологии.
Поскольку геномные ДНК разрезаны на множество фрагментов разной длины, они отображают мазок, как статус на гель ДНК. Это говорит о полном переваривании геномных ДНК. В качестве заключительного шага южного blotting, сигналы радиоактивности помечены зонд гибридизации с фрагментом ДНК цели показаны на пленке.
Появление ожидаемых полос отражает возникновение HR-событий в клонах ES. Согласно предварительному проекту в исследовании, клоны ES с мутировавшим аллеле имеют две различные диапазоны размера. В то время как дикие клоны типа ES имеют только одну полосу, предполагая, что желаемые клоны ES гетерозиготны.
После реакции ПЦР, продукты ПЦР могут быть проанализированы на гель ДНК. Если наблюдается определенная полоса NPCR правильного размера, это говорит о возникновении HR-событий, которые могут быть дополнительно подтверждены секвенированием этой полосы ПЦР. Смысл этого метода распространяется на терапию выявления точечных мутаций, потому что основа идентична.
При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы быть терпеливым и осторожным. После этой процедуры, другой метод, как микроинъекция клеток ES в бластоцисты могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительный вопрос, как там образование химерных животных. В сторону своего развития, этот метод проложил путь для исследователя в своей области молекулярной и клеточной биологии, чтобы исследовать функцию конкретного гена или следствие мутировавшего гена у мышей или за его пределами.
Не забывайте, что работа с радиоактивности этикетки P32 DCTB может быть чрезвычайно опасным и меры предосторожности, такие как экранирование с защитой борту всегда должны принимать при выполнении этой процедуры.
