Этот метод может помочь ответить на вопрос о том, как интеграция ВИЧ-провируса влияет на андрогинную экспрессию генов и почему в последнее время в ВИЧ-инфицированных клетках отбираются определенные сайты геномной интеграции. Основным преимуществом этого метода является то, что в пробирке модели для ВИЧ-инфекции могут быть произведены, которые несут провирусных репортеров, ориентированных на выбранных интеграционных сайтов с использованием CRISPR / Cas9 основе генома инженерии. Демонстрация процедуры будет Томас Вальтер, аспирант, и Джулия Bialek, postdoc из моей лаборатории.
Начните с использования UCSC Genome Browser для извлечения геномной последовательности желаемого геномного локуса, который будет мишенью. Для выбора руководства РНК из 20 нуклеотидов для таргетинга выбранного геномного локуса используйте веб-инструмент E-CRISP. Затем выберите, Homo Sapiens Геном Справочный консорциум геном человека: Построить 38.
Справочный геном как организм и входной 2000 базовых пар геномной последовательности, охватывающих желаемый геномный локус, ранее извлеченный. Начните поиск руководства-РНК, используя средние настройки приложения с любыми PAM, любые пять-премьер-базы, вне цели терпеть несоответствия и исключены интроны и острова CPG. Из списка с возможным руководством РНК конструкций, которые появляются, выберите руководство РНК с высоким баллом за специфику и эффективность, которая близка как можно ближе к желаемой геномного локуса, которые будут направлены.
Откройте браузер NCBI Blast, чтобы взорвать выбранную последовательность направляющий выступ-РНК против эталонного генома. Чтобы проверить уникальность выбранного направляющего-РНК-связывающего сайта, сначала выберите человека в качестве генома, а затем ввемите последовательность направляющего-РНК в качестве последовательности запросов. Затем выберите очень похожие последовательности или Mega Blast в качестве программы, чтобы убедиться, что руководство-РНК последовательность уникальна.
После этого выберите в силико 1000 базовых пар, вверх и вниз по течению последовательности направляющий-РНК из геномной последовательности, извлеченной в начале. Используйте эти выбранные 1000 базовых пар, вверх по течению и вниз по течению, как пять-премьер и три-премьер гомологии оружия для ориентации векторного строительства и примыстить репортер последовательности, которые будут направлены. За 24 часа до трансфекции юркатных Т-клеток подготовьйте одну полную пластину из 6 колодец клеток для одного целевого эксперимента.
Для начала пластина 1, 250 000 клеток в 2,5 миллилитров RPMI 1640 с добавками и без антибиотиков, на колодец. На следующий день добавьте к микрограммам круговой вектор таргетинга и два микрограмма Cas9 и плазмиду экспрессии направляющих РНК на колодец, до 250 микролитров коммерческой RPMI среды, оптимизированной для трансфекции, в реакционной трубке и хорошо перемешивайте вихрем. Затем медленно добавьте 12 микролитров трансфектного агента в СРЕДУ ДНК, не касаясь стенки трубки.
Флик трубки и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавить смесь dropwise к одному хорошо клеток. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе.
А через 72 часа после трансфекции потяните трансфицированные клетки, посчитайте их и подготовьтесь к обогащению FACS. После подтверждения целевых событий в смешанной целевой популяции клеток, начать генерации одноклеточных клонов путем подготовки jurkat-кондиционированных среды заранее, путем сбора RPMI с антибиотиками из здоровых, необработанных jurkat Т-клеток. Центрифуга труб в течение 5 минут при 300 G, и фильтровать супернатант с 25 миллилитров шприц, используя 0,22 микрометрового фильтра в новые, 50 миллилитров конических труб.
Подсчитайте целевые клетки, ранее обогащенные FACS, через 10-14 дней после расширения, а затем разбавьте их в RPMI антибиотиками до концентрации 100 000 клеток на миллилитр. Разбавить 100 микролитров этого разбавления клеток с 9,9 миллилитров среднего для достижения 1000 клеток на миллилитр. Затем разбавьте один миллилитр этого разбавления девятью миллилитров среднего до концентрации 100 клеток на миллилитр.
Чтобы пластина 96 хорошо пластины, чтобы содержать одну клетку на колодец, осторожно смешать один миллилитр 100-клеток на миллилитр раствор с пятью миллилитров состояние среднего и четыре миллилитров свежей среды, в стерильных реагентов резервуара. Затем используйте многоканарный пипетку, чтобы добавить 100 микролитров соответствующего разбавления клеток на колодец новых 96-хорошо круглых нижних пластин для достижения одной и двух ячеек на разбавления. Стек 96 хорошо пластин и покрыть каждый стек с шестью хорошо пластины, содержащие три миллилитров PBS на колодец.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию во влажном инкубаторе с 5%carbon dioxide, в течение трех недель. После завершения инкубации визуально подтвердите наличие выращенных колоний с помощью световой микроскопии с четырехкратным увеличением и отметйте колодцы выращенными колониями. Аккуратно resuspend клетки одного отмечены хорошо pipetting.
Перенесите 100 микролитров этой клеточной подвески в один колодец свежеприготовленной 96-хорошо круглой нижней пластины со 100 микролитров RPMI с антибиотиками, на колодец и повторите для всех отмеченных скважин, аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Чтобы дублировать пластину, перенесите 100 микролитров этой клеточной подвески во вторую пустую, 96-ну круглую нижнюю пластину и повторите этот процесс для всех отмеченных скважин. Наконец, заполните пустые скважины 200 микролитров RPMI с антибиотиками.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. После дубликат пластины инкубируется в течение 24 до 48 часов дублировать его снова, добавив 100 микролитров RPMI с антибиотиками в каждой хорошо. Используйте многоканарный пипетку, чтобы аккуратно перемешать и передать 100 микролитров в каждую колодец новой 96-хорошо круглой нижней пластины.
Поместите одну из этих двух дубликатов пластин в инкубатор. Используйте второй из новых дублирующих пластин для цитометрии потока, сначала добавив пять микролитров PMA/Ionomycin Master Mix на колодец, чтобы стимулировать клетки. Инкубировать в течение 24 часов и подготовить клетки для потока цитометрии, как описано в тексте.
Ворота любых жизнеспособных одиночных ячеек на основе размера в вперед и в сторону рассеяния. Проанализируйте экспрессию генов флуоресцентного репортера с помощью цитометрии потока. Для проверки одноклеточных клонов ПЦР, дизайн грунтовки P5 и P6 для скрининга ПЦР на основе выбранной последовательности репортера, чтобы усилить от 500 до 800 базовых пар репортер последовательности.
Для положительного контроля ПЦР, дизайн грунтовки P7 и P8, который усиливает 630 базовых пар дикого типа, не целевых геномных локусов. Создать третью грунтовочную пару, которая усиливает от 500 до 600 базовых пар позвоночника таргетинга-вектора в качестве контроля для неспецифической интеграции последовательностей позвоночника целевых векторов. После того, как клоны во второй дубликатной пластине выросли достаточно, подготовить их к скринингу ПЦР, сначала центрифугирование пластины в течение 10 минут при 300-G при комнатной температуре.
Аккуратно смахив супернатант, убедившись, что не беспокоить клеточные гранулы. Вымойте клетки 100 микролитров PBS нежным пипетки, центрифугирование пластины в течение пяти минут при 300 Г при комнатной температуре. Удалите PBS и добавьте 200 микролитров буфера лиза на колодец.
Пипетту аккуратно перемешать и перенести подвеску на новую пластину ПЦР. Печать пластины с парафиновой пленкой и инкубировать в течение одного часа при 55 градусов по Цельсию в термоциклер. После центрифугирования клеточного мусора на максимальной скорости в течение 10 минут, перенесите супернатант на новую пластину ПЦР.
Добавьте 10 микролитров этого листата клетки к каждому колодец 96-хорошо ПЦР пластины заполнены 110 микролитров дистиллированной H2O, на колодец. Затем инкубировать в течение 10 минут при 99 градусах по Цельсию в термоциклере, инактивировать протеиназу K.Use 2 микролитров этой клетки лизать в качестве шаблона и использовать коммерческий PCR мастер смесь для скрининга, управления и позвоночника ПЦР. Запустите PCR для 38 до 40 циклов усиления ПЦР в формате 96-колодец.
Используйте пять микролитров продуктов ПЦР и запустите их на 1,5%agarose TAE гель для анализа и объединения потока цитометрии и PCR результаты, чтобы подтвердить одноклеточных клонов. Экспрессия гена репортера после индукции PMA/Ionomycin была подтверждена как цитометрией потока, так и ПЦР в четырех-12% клеток, в зависимости от места интеграции. ПЦР-анализ геномной ДНК с использованием праймеров для пяти-премьер и трех-премьер-интеграции соединения, подтверждают, что таргетинг событий имели место.
После скрининга одноклеточных клонов для правильного таргетинга по цитометрии потока наблюдались клоны с высокой, низкой и отсутствием экспрессии генов флуоресцентного репортера. Одноклеточные клоны были также подтверждены ПЦР с помощью репортеров конкретных грунтовки и управления грунтовки. Клоны подтвердили положительные в скрининге ПЦР были израсходованы и дополнительно проанализированы для правильного ориентации на южной пятно, используя репортер-специфический зонд и геномного зонда связывания за пределами репортера.
Только часть показала правильные размеры полосы в южном анализе помарки и гетерозигно интегрировала репортера, показывая, что важно проверить результаты ПЦР по южной помарке. Клоны были также проанализированы с помощью секвенирования для дальнейшего подтверждения положительных одноклеточных клонов. Секвенирование целевого сайта: гомологичный аллель, были репортер не интегрированы, показали Cas9-индуцированных мутаций.
После освоения, генерация ВИЧ-репортер линий может быть достигнуто в течение двух-трех месяцев. До таргетинга важно тратить достаточно времени на выбор интеграционного сайта и соответствующего репортера, в зависимости от исследовательского вопроса, который вы хотели бы решить. Репортеры могут, например, при желании включать различные нормативные элементы в связи с ВИЧ.
Следуя этой процедуре, клеточные линии могут, например, использоваться для проверки влияния различных агентов роста задержки на транскрипционную активность репортера LTR, в зависимости от места его интеграции. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать интеграцию-сайт конкретных ВИЧ-репортер-линий для разработки руководства РНК и ориентации вектор, выполняя CRISPR / Cas9 основе генома инженерных в jurkat клеток, производство одноклеточных клонов и выбор для правильно целевых клонов FACS и PCR скрининга. Не забывайте, что если вы решили работать с репликацией компетентных ВИЧ-репортер, вы должны работать в условиях безопасности BSL3.
