Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области Т-клеточной иммунологии и разработки вирусных векторных вакцин. Основным преимуществом этого метода является то, что требуется лишь небольшое количество крови, что позволяет повторять измерения с одной и той же мыши. Кроме того, вирус и трансген-специфические CTLs могут быть обнаружены из одного и того же образца.
Демонстрацией процедуры будет джасмин Риннофнер, техник, и Анника Росслер, аспирантка. Измерение и анализ образцов будет Золтан Банки, пост-док. Для начала смело сдерживайте мышь в соответствии с текстовым протоколом.
Соберите 20 микролитров крови в трубке с покрытием ЭДТА из хвостовой вены мыши. При работе со спланоцитами изолируйте селезенку и используйте поршень шприца, чтобы нажать на ткань через клеточный ситечко. После выполнения лиза на эритроцитах, подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию образца.
Подготовка и маркировка одной трубки Facs для каждого образца, и передача 100 микролитров подвески органа, или 20 микролитров крови в трубку. При работе со спленоцитами центрифугировать суспензию органа в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта. Затем вихрь трубки, чтобы повторно использовать ячейки гранулы.
Для каждого канала, который будет использоваться, также подготовить Facs трубки для компенсации образца. Подготовь еще один образец в качестве незапачканного контроля. Подготовь трубку с буферами Facs с тетраперами при их оптимальном разбавлении и вихрем для смешивания.
Затем добавьте 50 микролитров разбавления тетрамера к каждому образцу и вихрь для смешивания. Добавьте буфер Facs без тетрамеров в элементы управления компенсацией и незапачканный образец. Затем инкубировать образцы в темных условиях при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут.
В то время как образцы инкубируются, добавьте буфер Facs в трубку. Затем добавьте антитела к буферу в соответствии с разбавлениями, указанными в таблице 2 текстового протокола, и вихрем раствора. В ожидании по научному вопросу могут быть использованы маркерные комбинации, помимо описанных здесь.
Убедитесь в том, чтобы всегда включать антитела против CD3 и CD8 в панели. Для каждого канала, подготовить трубку с 200 микролитров facs буфера, и добавить один микролитеров разбавления антител против CD8 в их соответствующем цвете, и вихрь для смешивания. Затем храните разбавления антител, как указано в текстовом протоколе.
Чтобы вымыть образцы, добавьте один миллилитер буфера Facs к образцам и центрифуге. Затем откажитесь от супернатанта и слейте оставшуюся жидкость бумажными полотенцами. При работе с кровью, будьте осторожны при сливе оставшейся жидкости.
До лиза эритроцитов, кровь не будет прилипать к нижней части трубки. Кроме того, вы можете аспирировать супернатанта. Затем добавьте 50 микролитров раствора антител к каждой клеточной грануле и вихрь осторожно.
Добавьте 50 микролитров каждой компенсационное сочетание в соответствующий контроль компенсации, и 50 микролитров буфера Facs к клеточной грануле неотренимного управления и вихрь мягко. При работе со спланоцитами, мыть образцы после окрашивания антител непосредственно с одного до двух миллилитров буфера Facs, и центрифуги в течение пяти минут. Затем отбросьте супернатант и слейте оставшуюся жидкость на бумажных полотенцах.
Добавьте 500 микролитров буфера ACK к каждому образцу крови и аккуратно вихрь. Затем инкубировать образцы в темноте в течение пяти минут при комнатной температуре. Добавьте один миллилитр буфера Facs в образцы и центрифугу.
Затем откажитесь от супернатанта и слейте оставшуюся жидкость бумажными полотенцами. Правильный лиз эритроцитов является важным шагом для облегчения измерения Facs, поэтому, когда гранулы довольно влажные, повторите лиз эритроцитов. Вымойте образцы снова, как описано ранее.
Затем отбросьте супернатант и слейте оставшуюся жидкость на бумажное полотенце. Перед фиксацией убедитесь, что клетки хорошо перерасходуются, чтобы предотвратить образование комков. Добавьте от 150 до 300 микролитров буфера фиксации Facs к каждой трубке и вихрь для смешивания.
Затем как можно быстрее приступить к цитометрическим измерениям потока. Во-первых, измерить контроль компенсации и правильно для любых спектральных перекрытий. После этого, настроить последовательные ворота, чтобы выбрать для CD3-положительных и CD8-положительных клеток.
Ворота на лимфоцитах, используя область рассеяния вперед и сбоку. Затем, в популяции лимфоцитов, ворота на одиночные клетки, используя вперед рассеяния ширины по сравнению с областью. Используйте каналы CD3 и CD8 для построения одноклеточных лимфоцитов.
Определите CD8-положительные Т-клетки, путем заготовки на CD3-положительных и CD8-положительных клетках. Убедитесь, что CD8-низкие ячейки включены в gating. Распространение на CD3/CD8-положительных ячейках является критическим шагом в этом протоколе.
Поскольку активация клеток часто приводит к снижению регуляции CD3 и/или CD8, следует также включить CD3/CD8-низкие клетки. После этого, участок CD8-положительных клеток по сравнению с тетрамерных клеток, gating на CD8-положительных / тетрамер-положительных клеток. Если это возможно, завемите 20 000 ячеек в CD3-положительных и CD8-положительных воротах для каждого образца.
Наконец, сохраните измерения в качестве файла FCS. В этом протоколе в образцах крови и тканей были количественно обнаружены антиген-специфические CD8-T-клетки. После отмахивания CD3-положительных и CD8-положительных клеток были выявлены тетрамер-положительные клетки.
Два разных тетрапера были объединены в одной трубке для окрашивания, что позволило одновременно количественно оценить две различные специфичности CTL. Используя этот протокол, Т-клетки ответы от той же мыши могут следовать с течением времени, так как только небольшое количество крови необходимы для каждого измерения. Кроме того, можно проанализировать фенотипы антиген-специфических КТЛ.
При попытке этой процедуры, важно, чтобы избежать длительного инкубации раз, так как это может привести к интернализации Т-клеточных рецепторов. С момента открытия тетрамерной технологии, тетрамерное окрашивание стало важным инструментом для анализа Т-клеток, и широкий спектр применений, которые включают тетрамеры начисления. Светлое будущее для ярких тетраперов.
