Фотоконверсия обеспечивает отслеживаемый метод in vivo для количественного анализа лейкоцитов для механистического понимания лейкоцитов проживания и динамики выхода из нескольких участков тканей в больных состояниях. Ну, здесь мы демонстрируем полезность отслеживания лейкоцитов от кокенозных опухолей. Применение этого анализа к другим тканям и заболеваниям ограничено только способностью управлять светом.
Основным преимуществом этого метода является то, что позволяет количественной оценки эндогенных, а не переданных популяций иммунных клеток, как выход из воспаленных тканей in vivo. Чтобы вызвать воспаление, подтвердив отсутствие реакции на щепотку носа, используйте микропипюту для введения 20 микролитров дибутилфталата или DBP, к брюшной стороне уха пинна обезболивающей трансгенной мыши Kaede. После разрешения DBP высохнуть, потяните ухо через щель в кусок алюминиевой фольги и использовать двустороннюю ленту, чтобы обеспечить ухо наотрез к фольге с спинной стороны лицом вверх.
Затем, положение, что вы находитесь непосредственно под 405 нанометров источник света и фотоконверт в течение трех минут на 100 милливатт мощности. Для вакцинной инфекции, используйте micropipette для введения 5 раз 10 до 6-го налета формирования единиц вируса вакцины в 10 микролитров PBS на ухо пинна анестезированы Kaede трансгенной мыши и тыкать пинна 25 раз. 24 часа спустя, фотоконверт Пинна, как только что продемонстрировали.
В соответствующую экспериментальную точку времени, урожай pinnae и шейки матки и паховой лимфатических узлов и использовать две пары пинцета, чтобы очистить друг от друга брюшной и спинной стороне каждой пинны. Затем поместите лимфатические узлы и кусочки пинна, с внутренней стороны уха лицом вниз, в отдельные колодцы 24-хорошо пластины, содержащей 1 миллиграмм на миллилитр коллагеназы D и 80 единиц на миллилитр Dnase разбавленной в HBSS, содержащих кальций и магний. Используйте два 29 калибровочных игл, чтобы дразнить открыть каждую капсулу лимфатических узлов и поместить пластину на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
В конце инкубации, нажмите переваренные ткани пинна и лимфатических узлов через отдельные 70 микрон нейлоновых клеток ситечко для получения одноклеточных суспензий каждой ткани. Когда опухоли выросли до соответствующего экспериментального размера, побрить любой недавно выращенный мех вокруг места опухоли и вытащить опухоль через круглое отверстие вырезать в кусок алюминиевой фольги. Распоитите опухоль непосредственно под 405 нанометровым источником света и фотоконвертом в течение 5 минут при 200 милливаттах мощности.
Через 24 часа после фотоконверсии, урожай опухолей и брахиальных и паховых лимфатических узлов от каждого животного и использовать ножницы, чтобы фарш опухолей в отдельных скважинах 24-хорошо пластины, содержащей коллагеназы D и DNase в HBSS. Поместите лимфатические узлы в отдельные скважины и дразнить открыть капсулы, как только что продемонстрировали. После инкубации опухолей в течение одного часа и лимфатических узлов в течение получаса при 37 градусах Цельсия, нажмите переваренные ткани через отдельные 70 микрон ситечко, чтобы получить одноклеточные суспензии каждой ткани.
Чтобы проанализировать одноклеточные суспензии по цитометрии потока, сначала собрать селезенку или кровь из Kaede трансгенной мыши и подлизить эритроциты с хлоридом хлорида аммонида калия буфера. Разделите клетки на одну неконвертированную Kaede FITC и одну преобразованную популяцию Kaede PE и перезаполните одноцветные клетки Kaede PE в один миллилитр PBS в одном из 24-колодец пластины, затем фотоконвертировать клетки в течение 5 минут под 405 нанометровый источник света на 100 милливатт мощности. Далее используйте фотоконвертированные клетки Kaede PE и неконвертированные клетки Kaede FITC, чтобы установить напряжение фотомультипель до 70-80% от общего диапазона каждого флуоресцентного канала.
После того, как напряжение для kaede белки были установлены, компенсировать все другие первичные пятна антитела с помощью одного фторфора помечены компенсации бисера, в соответствии с инструкциями производителя. Затем запустите образцы на цитометре потока в соответствии со стандартными протоколами цитометрического анализа потока. Одноклеточные суспензии, генерируемые из кожи уха или шейных дренажных лимфатических узлов сразу же после фотоконверсии воздействия выявить 78%конверсии эффективности всех CD45 положительных лейкоцитов в коже, без преобразованных клеток наблюдается в дренажных лимфатических узлов.
Количественная оценка числа проникающих CD45 положительных лейкоцитов в фотоконвертированных ушах ноль и 24 часа после преобразования, показывает, что воздействие фиолетового света вызывает статистически значимое увеличение инфильтрации лейкоцитов. Это увеличение CD45 положительное проникновение лейкоцитов однако, является небольшим по отношению к инфильтрации, вызванной мощным воспалительным стимулом, таким как вирус вакцины. Фотоконверсия также увеличивает проницаемость сосудов в ухе pinnae, как измеряется Майлз анализа, а также о том, что влияние фиолетового света на воспаление тканей должны быть рассмотрены при оптимизации дозы, время экспозиции и интерпретации данных.
Поток цитометрического анализа диссоциированных опухолевых клеток от фотоконвертированных животных показывает значительное преобразование внутриопухолевых CD45 положительных клеток из Kaede FITC положительные к Kaede PE положительные, в то время как дренажные клетки лимфатических узлов остаются неконвертированными. Эффективность фотоконверсии положительных лейкоцитов CD45 значительно различалась между типами и размерами опухолей, при этом положительные лейкоциты CD45 в небольших опухолях меланомы демонстрируют наиболее эффективную фотоконверсию. По мере увеличения объемов опухоли эффективность преобразования снижается примерно до 50%, в частности, меланин оказывает поразительное влияние на эффективность фотоконверсии с максимальной фотоконверсией положительных клеток CD45, наблюдаемых в опухолях, производящих меланин, всего около 30% в небольших опухолях, что падает до 10%по мере приближения объемов опухоли к 400 кубическим миллиметрам.
Исследование опухолевых дренажных лимфатических узлов через 24 часа после фотоконверсии показывает наличие у Kaede красных положительных иммунных клеток различных фенотипов, демонстрируя тем самым эмиграцию лейкоцитов из фотоконвертной опухоли. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области иммунологии, чтобы раскрыть кинетику стабильного состояния и воспаленной лейкоцитов оборота в периферической ткани. При попытке этой процедуры, важно убедиться, что только ткани, представляющие интерес фотоконверт, как непреднамеренное фотоконверсии окружающих тканей поставит под угрозу ваши результаты.
Лица, новые для этого метода должны оптимизировать время экспозиции для преобразования их ткани, а также продолжительность времени до сбора тканей происходит на основе динамики лейкоцитов интереса.
