Мини-эндоскопическая оценка толстой кишки у живых мышей обеспечивает ключевую экспериментальную поддержку для исследования кишечных проявлений острого графа против хозяина болезни, GvHD, на алогенных, гематопоэтических трансплантации стволовых клеток. Неинвазивная оценка острого Колита, связанного с GvHD, может функционировать как рабочая замена гистопатологии золотого стандарта, тем самым делая неоднократные жертвы животных для получения образцов тканей ненужными. Демонстрацией процедуры будет Вера Бучеле, пост-док из моей лаборатории.
На следующий день после облучения всего тела реципиента BALB/c мышей, поместите CD-45.1 жить 5B6 SJL донорской мыши в склонном положении на чистой рабочей оболочке, и использовать один 13-сантиметровый изогнутый и зубчатый кончик simkin типсов поднять мех на одной ахиллесовой пятой. Используя затвердевшие 8,5-сантиметровые тонкие ножницы с прямыми кончиками, наклоняйте кожу между типсами и одной пяткой, удлиняя разрез черепно, чтобы облегчить удаление кожи и меха из задних конечностей. Когда кожа была удалена из задних конечностей, прорезать каждый бедра, лодыжки и коленного сустава.
Храните бедро и хвостовик каждой задней конечности в одной 92-мм чашке Петри, наполненной ПВЗ на льду, и тщательно удалите как можно больше мышц из каждой кости, передавая каждую очищенную бедренную кость и голень в 50-млную трубку стерильной RPMI 1640 среды на мокром льду. Чтобы изолировать костный мозг, перенесите одну кость одновременно в новую чашку Петри 92 мл, наполненную свежей средой RPMI 1640, и используйте скальпель, чтобы отрезать концы каждой кости. Затем используйте шприц 1 мл, оснащенный иглой 26-го калибра, чтобы промыть кости 1 мл свежей среды одновременно в трубку для сбора 50 мл, содержащую 5 мл среды.
Когда все кости были покраснели, осторожно пипетки рассыпчатый костного мозга штук вверх и вниз несколько раз, чтобы генерировать одноклеточную подвеску перед фильтрацией клеток через 40-микрометровый сетки экрана клетки ситечко в новую трубку сбора 50 мл. Пеллет клетки центрифугации и повторно приостановить клетки в 5 мл хлорида аммония хлорид калия лиза буфера для трехминутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, остановить реакцию с 10 мл ПВХ, и центрифуга клеток снова.
Повторно приостановить гранулы в 2 мл свежих ПВХ для подсчета, и выделить шесть раз 10 до шестой ячейки aliquot для вниз по течению потока цитометрического анализа. Далее, используйте коммерчески доступный комплект очистки клеток для магнитного истощения CD90.2-положительных Т-клеток из одноклеточной подвески костного мозга, в соответствии с инструкциями производителя, и отложите один раз от 10 до шестой клеточной алициты Т-клеток, истощенных элуат для вниз по течению потока цитометрического анализа чистоты клеток и состава до и после разделения. Затем используйте шприц 1 мл, оснащенный иглой 30-го калибра, чтобы вводить пять раз от 10 до пятого Т-клеточного истощенных клеток костного мозга в 100 микролитров ПВЗ внутривенно в ретробулбарное пространство венозной пазухи каждого облученого животного-реципиента.
На следующий день поместите селезенку, собранную у животного-донора, на 40-микрометровый сетчатый ситечко в трубке для сбора 50 мл и используйте поршень шприца, чтобы нажать на селезенку через ситечко в трубку. Вымойте ситечко и поршень с ПВХ, чтобы собрать все спеноциты, и гранулы клеток центрифугации. После того, как красные кровяные клетки лиза продемонстрирована, повторно приостановить белые кровяные тельца для подсчета, и выделить шесть раз 10 до шестой клеточной aliquot для вниз по течению потока цитометрического анализа.
Для общей CD3-положительной изоляции Т-клеток от общего количества спланоцитов используйте коммерчески доступный комплект для очистки клеток в соответствии с инструкциями производителя и отложите один раз от 10 до шестого CD3-положительного T-клеточного алицита из положительной фракции клеток для цитометрического анализа цитометрического анализа чистоты и состава клеток до и после разделения. Затем ввимите семь раз от 10 до пятого алорактивного CD3-положительного Т-клеток в 100 микролитров ПВХ внутривенно в ретробульбарное пространство каждой мыши-получателя, чтобы вызвать GvHD. Чтобы забить GvHD связанных поражений с помощью мини-эндоскопии дистальной колоректальной области, поднимите хвост животного-реципиента чуть выше хвоста корня с одной стороны, и использовать другую руку, чтобы тщательно вставить эндоскоп в прямую кишку через анус.
В то время как поток воздуха раздувает колоректальный люмен, медленно и осторожно двигайте эндоскоп вперед в аборигенное направление. Чтобы избежать травм толстой кишки кишечника, держать эндоскоп в средней области люмена с помощью живого видеоэкрана, чтобы помочь в этом позиционировании. Начните записывать видео поток и забил воспаление, оценивая GvHD связанных воспаление толстой кишки, забив параметры, как показано на примере.
Когда скоринг пятно было расположено, переместить эндоскоп мягко и немного вперед и назад, чтобы оценить различные параметры. Для оценки параметра прозрачность и консистенция стула, положение эндоскоп на более широком расстоянии по отношению к толстой стенке. Для оценки детализации и сосудистости поражения, положение эндоскопа в непосредственной близости от толстой стенки, и тщательно применять хорошо досированное напряжение толстой стенки с кончиком эндоскопа.
По завершении процесса подсчета очков, остановить запись. По сравнению с контролем, алогенная гематопоиевтная трансплантация стволовых клеток, как было продемонстрировано, производит воспроизводимо надежную индукцию системного фенотипа GvHD, с постепенно увеличивающейся клинической оценкой GvHD у животных-реципиентов. Эти мини-эндоскопически оцениваемые критерии были специально адаптированы из ранее зарегистрированного сингенеического колита в контексте ало-ответ-управляемых параметров скоринга колита для точного описания, скоринга и классификации кишечных GvHD-заболеваний, связанных с поражениями в дистальной толстой кишке.
Действительно, мини-эндоскопически основанная система классификации позволяет легкой дискриминации доноров-лимфоцитов, принимающих мышей с тяжелыми признаками воспаления кишечника от контрольных мышей, которые по существу лишены GvHD. Инвалидизация мини-эндоскопически основанной системы классификации гистопатологических исследований подтвердила, что толстая кишка мышей, серьезно пострадавших от воспаления, связанного с GvHD, проявляет столь же сильные гистопатологические признаки воспаления. В отличие от этого, ткани толстой кишки контрольных мышей не проявляли, в крайнем случае, легких гистопатологических признаков воспаления, в согласии с фактическим отсутствием мини-эндоскопически обнаруживаемых признаков колита.
Кроме того, корреляционные исследования между мини-эндоскопически и гистопатологически оцененной активностью колита и системными показателями GvHD показывают, что мини-эндоскопически определенные некоторые оценки менее или равны трем надежно предсказывают отсутствие среднего и более высокого класса кишечного GvHD-ассоциированного воспаления толстой кишки, полученных от гистопатологической классификации. Кроме того, тяжесть эндоскопически оцененной кишечной GvHD показывает корреляцию с системной активностью GvHD болезни. Для стандартизации результатов мини-эндоскопической оценки воспаления толстой кишки и обеспечения сопоставимости различных мышей и экспериментов с течением времени, определенный анатомичный сайт должен быть выбран для скоринга.
В дополнение к скоринга воспаления толстой кишки, встроенный рабочий канал в мини-эндоскопической установки позволяет извлечения зрения управляемых биопсий тканей, применимых к различным анализам вниз по течению, таких как стандартная гистопатология. Из-за неинвазивного характера мини-эндоскопии, острый Колит, связанный с GvHD, может быть неоднократно оценен в пределах одного и того же животного практически в любое время, тем самым позволяя увлекательное понимание кишечного GvHD.
