살아있는 마우스에 있는 결장의 미니 내시경 평가는 충진성, 조혈 줄기 세포 이식에 급성 그래프 대 숙주 질병, GvHD의 장 발현을 조사하기 위한 중요한 실험적인 지원을 제공합니다. 급성 GvHD 관련 대장염의 비침습적 평가는 금 본위제 조직 병리학의 작업 대체품으로 기능할 수 있으므로 조직 표본을 불필요하게 얻기 위해 반복되는 동물 희생을 렌더링합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 베라 Buchele 될 것입니다.
수령인 BALB/c 마우스의 총 신체 조사 후 하루, 깨끗한 작업 칼집에 대한 경향 위치에 CD-45.1 라이브 5B6 SJL 기증자 마우스를 배치하고, 하나의 아킬레스 건에서 모피를 들어 올리기 위해 심킨 포셉의 13cm 곡선과 톱니 티드 팁을 사용합니다. 직선 팁으로 강화 된 8.5cm 미세 가위를 사용하여 집게와 발 뒤꿈치 사이에 피부를 절개하고 절개를 추리하여 뒷다리에서 피부와 털을 제거합니다. 피부가 뒷두부에서 제거되면 각 엉덩이, 발목 및 무릎 관절을 잘라냅니다.
모든 뒷다리의 허벅지와 생크를 얼음 위에 PVS로 채워진 92mm 페트리 접시에 넣고 각 뼈에서 가능한 한 많은 근육을 조심스럽게 제거하여 청소된 각 대퇴골과 경골을 젖은 얼음에 있는 멸균 RPMI 1640 배지의 50mL 튜브로 옮겨 넣습니다. 골수를 분리하려면 한 번에 하나의 뼈를 신선한 RPMI 1640 배지로 채워진 새로운 92mL 페트리 접시로 옮기고 메스를 사용하여 각 뼈의 끝을 잘라냅니다. 다음으로, 26게이지 바늘을 장착한 1mL 주사기를 사용하여 1mL의 신선한 배지로 뼈를 한 번에 1mL의 신선한 배지로 플러시하여 5mL의 배지를 포함하는 50mL 수집 튜브로 플러시한다.
모든 뼈가 플러시되었을 때, 부스러기 골수 조각을 여러 번 부드럽게 피펫하여 40 마이크로미터 메쉬 스크린 셀 스트레이너를 통해 세포를 새로운 50mL 수집 튜브로 필터링하기 전에 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. 원심분리에 의해 세포를 펠렛하고 실온에서 3분 동안 염화칼륨 용해 버퍼의 5mL에서 세포를 다시 중단한다. 인큐베이션의 끝에서, PVS의 10 mL로 반응을 중지하고 세포를 다시 원심 분리합니다.
계산을 위해 2mL의 신선한 PVS에서 펠릿을 다시 중단하고, 다운스트림 흐름 사이토메트릭 분석을 위해 6회 10번을 제6세포 알리쿼트에 따로 둡니다. 다음으로, 제조자의 지시에 따라 골수 단일 세포 현탁액으로부터 CD90.2 양성 T 세포를 자기적으로 고갈시키고, T 세포 고갈 된 용액의 6 세포 알리쿼트의 1회 10을 제쳐 놓고 세포 순도 및 분해 후 분해 후 의 하류 흐름 세포 측정 분석을 위해 시판되는 세포 정화 키트를 사용합니다. 이어서, 30게이지 바늘을 장착한 1mL 주사기를 사용하여 각 조사 받는 동물의 정맥 부비동의 소리항 공간에 정맥내100 마이크로리터에서 제5 T 세포 고갈된 골수 세포에 5배 10회 주입한다.
다음 날, 기증자 동물에서 수확한 비장을 50mL 수집 튜브에 40 마이크로미터 메쉬 스트레이너에 넣고 주사기 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 비장 조직을 튜브로 누릅니다. 스트레이너와 플런저를 PVS로 세척하여 모든 비장 구종을 수집하고 원심분리로 세포를 펠렛합니다. 적혈구 용해가 입증된 후, 백혈구를 다시 중단하고, 다운스트림 흐름 세포 분석용 6회 10번을 제6세포 알리쿼트로 따로 둡니다.
총 비장세포로부터의 총 CD3 양성 T세포 절연의 경우 제조업체의 지시에 따라 시판되는 세포 정화 키트를 사용하고, 분리 전후의 세포 순도 및 조성물의 다운스트림 흐름 세포 측정 분석을 위해 양성 셀 분획으로부터 10~6번째 CD3 양성 T-셀 알리쿼트를 1회 따로 따로 설정한다. 이어서, 각 수신자 마우스의 소리항 공간에 정맥내적으로 PVS의 100 마이크로리터에 제5 내5개의 내소활성 CD3 양성 T 세포에 7회 10회 주입하여 GvHD를 유도한다. 탈색 대장 부위의 미니 내시경검사에 의해 GvHD 관련 병변을 채점하려면, 한 손으로 꼬리 뿌리 바로 위에 받는 동물의 꼬리를 들어 올리고, 다른 손으로 항문들을 통해 직장에 내시경을 조심스럽게 삽입한다.
공기 스트림은 대장 루멘을 팽창하는 동안, 천천히 조심스럽게 내시경을 복부 방향으로 앞으로 이동합니다. 대장 내시경을 피하기 위해 이 포지셔닝을 돕기 위해 라이브 비디오 화면을 사용하여 루멘의 중간 부위에 내시경을 유지하십시오. 비디오 스트림을 기록하고 염증을 채점하기 시작하여 그림과 같이 매개 변수를 채점하여 결장의 GvHD 관련 염증을 평가합니다.
점수점이 있는 경우 내시경을 부드럽게 약간 앞뒤로 이동하여 다양한 매개 변수를 평가합니다. 매개 변수 투명도 및 대변 일관성을 평가하기 위해 내시경을 대장 벽과 관련하여 더 넓은 거리에서 배치합니다. 병변의 세분성과 혈관을 평가하기 위해 내시경을 식민지 벽에 근접하게 배치하고 내시경 의 끝으로 대장 벽에 잘 투하된 장력을 신중하게 적용합니다.
점수 매기기 프로세스가 완료되면 기록을 중지합니다. 대조군과 비교하여, 항생성 조혈 세포 이식은 수용자 동물에서 임상 GvHD 점수를 점진적으로 증가와 함께 전신 GvHD 표현형의 재현 가능하게 강력한 유도를 생성한다. 이러한 미니 내시경 평가 기준은 탈모 결장에서 장 GvHD-질병 관련 병변의 정확한 설명, 채점 및 채점 파라미터에 대한 알로 반응 중심의 대장염 점수 파라미터의 맥락에서 이전에 보고된 syngeneic 대장염으로부터 특별히 조정되었다.
실제로, 미니 내시경 기반 채점 시스템은 본질적으로 GvHD가 없는 대조마우스로부터 장 염증의 심각한 징후를 가진 기증자 림프구 수신 마우스의 쉬운 차별을 가능하게 합니다. 대조적으로, 대조마우스의 결장 조직은 대장염의 미니 내시경 검출 가능한 징후의 가상 부재와 합의하여 염증의 온화한 조직 병리학 적 징후를 표시하지 않았다.
더욱이, 미니 내시경 및 조직 병리학적으로 평가된 대장염 활동과 전신 GvHD 점수 사이의 상관 관계 연구는 미니 내시경 학적으로 3 개 이하의 일부 점수를 안정적으로 조직 병리학 적등급 등급에서 얻은 중상 에서 높은 등급의 GvHD 관련 대장 염증 점수의 부재를 예측한다는 것을 보여줍니다. 또한 내시경 평가된 장 GvHD의 심각도는 전신 GvHD 질병 활성과의 상관관계를 나타낸다. 대장 염증의 미니 내시경 평가 결과를 표준화하고 시간이 지남에 따라 다른 마우스와 실험에 걸쳐 비교성을 보장하기 위해, 정의 된 해부학 부위를 점수를 위해 선택되어야한다.
대장 염증을 채점하는 것 외에도 미니 내시경 설정 내의 내장 작업 채널은 표준 조직 병리학과 같은 다양한 다운스트림 분석에 적용되는 보기 유도 조직 생검을 검색 할 수 있습니다. 미니 내시경 검사의 비침습적 특성으로 인해 급성 GvHD 관련 대장염은 거의 언제든지 동일한 동물 내에서 반복적으로 평가될 수 있으므로 장 GvHD에 매혹적인 통찰력을 얻을 수 있습니다.
