A avaliação mini-endoscópica do cólon em camundongos vivos fornece suporte experimental fundamental para investigar manifestações intestinais da doença aguda de gráfico versus hospedeiro, GvHD, sobre transplante alergênico e hematopoiético de células-tronco. A avaliação não invasiva da colite aguda relacionada à GvHD pode funcionar como um substituto de trabalho para histopatologia padrão-ouro, tornando assim repetidos sacrifícios animais para obter amostras de tecido desnecessárias. Demonstrando o procedimento será Vera Buchele, uma pós-doutora do meu laboratório.
Um dia após a irradiação total do corpo dos camundongos BALB/c receptores, coloque um rato doador CD-45.1 live 5B6 SJL na posição propensa em uma bainha de trabalho limpa, e use uma ponta curva e serrilhada de 13 cm de um fórceps simkin para levantar a pele em um calcanhar de Aquiles. Utilizando uma tesoura fina endurecida de 8,5 cm com pontas retas, inciso a pele entre as fórceps e um calcanhar, alongando a incisão cranialmente para facilitar a remoção da pele e pele dos membros traseiros. Quando a pele tiver sido removida dos membros traseiros, corte cada quadril, tornozelo e articulação do joelho.
Armazene a coxa e a haste de cada membro traseiro em uma única placa de Petri de 92 mm cheia de PVS no gelo e remova cuidadosamente o máximo de músculo possível de cada osso, transferindo cada fêmur limpo e tíbia em um tubo de 50 mL de meio RPMI 1640 estéril em gelo molhado. Para isolar a medula óssea, transfira um osso de cada vez em uma nova placa de Petri de 92 mL cheia de meio RPMI 1640 fresco, e use um bisturi para cortar as extremidades de cada osso. Em seguida, use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 26 para lavar os ossos com 1 mL de meio fresco de cada vez em um tubo de coleta de 50 mL contendo 5 mL de média.
Quando todos os ossos foram lavados, pipeta suavemente as peças de medula óssea desintegradas várias vezes para gerar uma suspensão de célula única antes de filtrar as células através de um filtro de células de tela de malha de 40 micrômetros em um novo tubo de coleta de 50 mL. Pelotar as células por centrifugação e suspender as células em 5 mL de tampão de potássio de cloreto de amônio para uma incubação de três minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, pare a reação com 10 mL de PVS, e centrifugar as células novamente.
Suspenda a pelota em 2 mL de PVS fresco para contagem, e reserve uma alíquota de seis vezes 10 para a sexta célula para análise citométrica de fluxo a jusante. Em seguida, use um kit de purificação celular comercialmente disponível para esgotar magneticamente as células T CD90.2 positivas da suspensão unicelular da medula óssea, de acordo com as instruções do fabricante, e reserve uma vezes 10 para a sexta alíquota celular do eluato empobrecido de células T para análise citométrica de fluxo a jusante da pureza e composição celular antes e depois da separação. Em seguida, use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 30 para injetar cinco vezes 10 para o quinto T-células esgotadas células de medula óssea em 100 microliters de PVS intravenosamente no espaço retrobulbar do seio venoso de cada animal receptor irradiado.
No dia seguinte, coloque um baço colhido de um animal doador em um filtro de malha de 40 micrômetros em um tubo de coleta de 50 mL, e use um êmbolo de seringa para pressionar o tecido do baço através do coador no tubo. Lave o coador e o êmbolo com PVS para coletar todos os esplenócitos e pelota as células por centrifugação. Após a demonstração da lise dos glóbulos vermelhos, suspenda as células brancas do sangue para contagem e reserve seis vezes 10 para a alíquota da sexta célula para análise citométrica do fluxo a jusante.
Para um isolamento total de células T CD3 positivos de esplenócitos totais, use um kit de purificação celular comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante, e reserve uma vezes 10 para o sexto cd3-positivo aliquot de células T da fração celular positiva para análise citométrica de fluxo a jusante da pureza e composição celular antes e depois da separação. Em seguida, injete sete vezes 10 para as quintas células T altorativas CD3-positivas em 100 microliters de PVS intravenosamente no espaço retrobulbar de cada rato receptor para induzir GvHD. Para escorar lesões relacionadas à GvHD por mini-endoscopia da região colorretal distal, levante a cauda de um animal receptor logo acima da raiz da cauda com uma mão, e use a outra mão para inserir cuidadosamente o endoscópio no reto através do ânus.
Enquanto a corrente de ar infla o lúmen colorretal, mova lentamente e cuidadosamente o endoscópio para a frente na direção aboral. Para evitar lesões intestinais coloniais, mantenha o endoscópio na área média do lúmen usando a tela de vídeo ao vivo para ajudar neste posicionamento. Comece a gravar o fluxo de vídeo e marcar a inflamação, avaliando a inflamação relacionada à GvHD do cólon, marcando os parâmetros como ilustrado.
Quando um ponto de pontuação estiver localizado, mova o endoscópio suavemente e ligeiramente para frente e para trás para avaliar os diferentes parâmetros. Para avaliar a translucência do parâmetro e a consistência das fezes, posicione o endoscópio a uma distância maior em relação à parede colonial. Para avaliar a granularidade e vascularização da lesão, posicione o endoscópio nas proximidades da parede colonial e aplique cuidadosamente tensão bem dosada à parede colonial com a ponta do endoscópio.
Após a conclusão do processo de pontuação, pare a gravação. Em comparação com os controles, o transplante de células-tronco hematopoiísicos alergênicos como demonstrado produz uma indução reprodutivelmente robusta de um fenótipo sistêmico de GvHD, com aumento progressivo dos escores clínicos de GvHD em animais receptores. Esses critérios mini-endoscopicamente avaliados foram especificamente adaptados da colite síngênica relatada anteriormente no contexto de parâmetros de pontuação de colite orientadas por ao-resposta para a descrição precisa, pontuação e classificação de lesões associadas à doença de GvHD intestinal no cólon distal.
De fato, o sistema de classificação mini-endoscopicamente baseado permite uma fácil discriminação de camundongos receptores de linfócitos com sinais graves de inflamação intestinal de camundongos de controle que são essencialmente desprovidos de GvHD. A invalidação do sistema de classificação baseado em mini-endoscopicamente estudos histopatológicos confirmaram que o cólon de camundongos severamente afetados pela inflamação relacionada à GvHD apresenta sinais histopatológicos igualmente fortes de inflamação. Em contraste, os tecidos de cólon dos camundongos de controle apresentaram não para, no máximo, sinais histopatológicos leves de inflamação, de acordo com a ausência virtual de sinais mini-endoscopicamente detectáveis de colite.
Além disso, estudos de correlação entre a atividade de colite mini-endoscopicamente e histopatológicamente avaliada e os escores sistêmicos de GvHD demonstram que mini-endoscopicamente determinados alguns escores de menos ou igual a três predizem de forma confiável a ausência de escores de inflamação coloniais associados ao GvHD intestinal de médio a maior grau obtidos a partir da classificação histopatológica. Além disso, a gravidade do GvHD intestinal avaliado endoscopicamente mostra correlação com a atividade sistêmica da doença de GvHD. Para padronizar os resultados da avaliação mini-endoscópica da inflamação colonica e garantir a comparabilidade entre diferentes camundongos e experimentos ao longo do tempo, um local anatômico definido deve ser selecionado para pontuação.
Além de marcar inflamação cólon, o canal de trabalho incorporado dentro da configuração mini-endoscópica permite a recuperação de biópsias de tecido guiadas por visão aplicáveis a várias análises a jusante, como histopatologia padrão. Devido à natureza não invasiva da mini-endoscopia, a colite aguda relacionada à GvHD pode ser repetidamente avaliada dentro do mesmo animal em praticamente qualquer momento, produzindo assim insights fascinantes sobre o GvHD intestinal.
