20- يوفر التقييم بالمنظار المصغر للكولون في الفئران الحية الدعم التجريبي الرئيسي للتحقيق في المظاهر المعوية للمرض الحاد في الرسم البياني مقابل المستضيف، GvHD، عند زرع الخلايا الجذعية المسببة للحساسية، والخلايا الجذعية المسببة للدم. التقييم غير الغازية من التهاب القولون الحاد ذات الصلة GVHD يمكن أن تعمل كبديل للعمل من علم الأنسجة القياسية الذهب، وبالتالي جعل التضحيات المتكررة الحيوانية للحصول على عينات الأنسجة غير ضرورية. إثبات الإجراء سيكون (فيرا بوشيلي) ، طبيبة ما بعد الدكتوراه من مختبري
بعد يوم واحد من التشعيع الكلي للجسم من الفئران BALB / c المتلقي ، ضع ماوس متبرع CD-45.1 الحي 5B6 SJL في الموقف المعرض على اغلد عمل نظيف ، واستخدم طرفًا واحدًا منحنيًا و مسننة من ملقط simkin لرفع الفراء في كعب أخيل واحد. باستخدام مقص ناعم 8.5 سم متصلب مع نصائح مستقيمة ، قم بثني الجلد بين ملقط وكعب واحد ، ممدود الشق بجريه لتسهيل إزالة الجلد والفراء من الأطراف الخلفية. عندما يتم إزالة الجلد من الأطراف الخلفية، وقطع من خلال كل مفصل الورك والكاحل والركبة.
تخزين الفخذ والساق من كل طرف خلفي في طبق بيتري واحد 92 ملم مليئة PVS على الجليد وإزالة بعناية أكبر قدر ممكن من العضلات من كل عظمة، ونقل كل عظم الفخذ وتنظيفها والساق في أنبوب 50 مل من 1640 1640 معقم 1640 1640 المتوسطة على الجليد الرطب. لعزل نخاع العظم، نقل عظمة واحدة في وقت واحد إلى طبق بيتري جديد 92 مل مملوءة بـ RPMI 1640 المتوسطة الطازجة، واستخدم مشرطًا لقطع أطراف كل عظمة. بعد ذلك، استخدم حقنة 1 مل مجهزة بإبرة قياس 26 لطرد العظام مع 1 مل من المتوسطة الطازجة في وقت ما في أنبوب جمع 50 مل تحتوي على 5 مل من المتوسط.
عندما تم مسح جميع العظام، ماصة بلطف قطع نخاع العظام متفتت صعودا وهبوطا عدة مرات لتوليد تعليق خلية واحدة قبل تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية شبكة الشاشة 40 ميكرومتر في أنبوب جمع جديد 50 مل. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل من كلوريد الأمونيوم تحلل البوتاسيوم العازلة لمدة ثلاث دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، ووقف رد فعل مع 10 مل من PVS، والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى.
إعادة تعليق بيليه في 2 مل من PVS جديدة للعد، وتوضع جانبا ست مرات 10 إلى aliquot الخلية السادسة لتحليل تدفق مجرى النهر. بعد ذلك، استخدم مجموعة تنقية الخلايا المتاحة تجارياً لنضوب خلايا T إيجابية CD90.2 من نظام التعليق أحادي الخلية نخاع العظم، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، وتوضع جانباً مرة واحدة 10 إلى الخلية السادسة من eluate الخلايا T-المنضب للتحليل الخلوي تدفق المصب من نقاء الخلية وتكوينها قبل وبعد الانفصال. ثم، استخدام حقنة 1 مل مجهزة بإبرة 30 قياس لحقن خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة T-الخلايا المنضب خلايا نخاع العظام في 100 ميكرولترات من PVS عن طريق الوريد في الفضاء الرجعية من الجيوب الأنفية الوريدية من كل المتلقي المشع.
في اليوم التالي، ضع طحالًا تم حصاده من متبرع على مصفاة شبكية 40 ميكرومتر في أنبوب جمع 50 مل، واستخدم المكبس المحاقن للضغط على أنسجة الطحال من خلال المصفاة في الأنبوب. غسل المصفاة والمغطس مع PVS لجمع كل الطحال، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد أن ثبت تحلل خلايا الدم الحمراء، وإعادة تعليق خلايا الدم البيضاء للعد، وتوضع جانبا ست مرات 10 إلى aliquot الخلية السادسة لتحليل تدفق مجرى النهر.
للحصول على مجموع CD3 إيجابية T-الخلية العزل من مجموع الطحال، واستخدام مجموعة تنقية الخلايا المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وتوضع جانبا مرة واحدة 10 إلى سادس CD3 إيجابية T-الخلية aliquot من الخلية الإيجابية كسر لتحليل تدفق تدفق أسفل النهر من نقاء الخلية وتكوينها قبل وبعد الانفصال. ثم، حقن سبع مرات 10 إلى الخامس alloreactive CD3 إيجابية الخلايا التائية في 100 ميكرولترات من PVS عن طريق الوريد في الفضاء الرجعية من كل فأر المتلقي للحث على GvHD. لتسجيل الآفات ذات الصلة GvHD عن طريق التنظير مصغرة من المنطقة القولونية، ورفع ذيل المتلقي فقط فوق جذر الذيل بيد واحدة، واستخدام اليد الأخرى لإدراج بعناية المنظار في المستقيم عبر فتحة الشرج.
في حين أن تيار الهواء يضخم تجويف القولون والمستقيم، ببطء وبعناية تحريك المنظار إلى الأمام في اتجاه البورال. لتجنب إصابات القولون، والحفاظ على المنظار في المنطقة الوسطى من التجويف باستخدام شاشة الفيديو الحية للمساعدة في هذا الموضع. ابدأ في تسجيل تدفق الفيديو وسجل الالتهاب، وتقييم التهاب القولون المرتبط بـ GvHD من خلال تسجيل المعلمات كما هو موضح.
عندما تم تحديد موقع تسجيل، نقل المنظار بلطف وقليلا ذهابا وإيابا لتقييم المعلمات المختلفة. لتقييم تناسق المعلمة والبراز، ضع المنظار على مسافة أوسع بالنسبة إلى جدار القولون. لتقييم الحبيبات والأوعية الدموية من الآفة، وضع المنظار في القرب من جدار القولون، وتطبيق بعناية التوتر جيدا الدوس على جدار القولون مع غيض من المنظار.
عند الانتهاء من عملية التسجيل، إيقاف التسجيل. بالمقارنة مع الضوابط، زرع الخلايا الجذعية المسببة للحساسية كما هو موضح ينتج تحريض قوية مستنسخة من النمط الظاهري GvHD النظامية، مع زيادة تدريجية عشرات GvHD السريرية في الحيوانات المتلقية. تم تكييف هذه المعايير المصغرة القابلة للتقييم بالمنظار خصيصًا من التهاب القولون السينيجيني المبلغ عنه سابقًا في سياق معلمات تسجيل التهاب القولون القائم على الاستجابة للوصف الدقيق والتسخيص والدرجات للآفات المرتبطة بمرض GvHD المعوية في القولون القاصي.
في الواقع ، فإن نظام الدرجات القائم على المناظير المصغرة يتيح تمييزًا سهلًا للفئران المتلقية للغدد الليمفاوية المانحة مع علامات شديدة على التهاب الأمعاء من فئران التحكم التي تخلو من GvHD . في المقابل ، لم تظهر أنسجة القولون من الفئران التحكم في عدم وجود ، على الأكثر ، علامات التهاب الأنسجة الهدولوجية المعتدلة ، بالاتفاق مع الغياب الفعلي لعلامات التهاب القولون القابلة للكشف عن منظار صغير.
وعلاوة على ذلك، دراسات الارتباط بين مصغرة بالمنظار وهستووباولوجي تقييم نشاط التهاب القولون ودرجات GvHD النظامية تثبت أن مصغرة بالمنظار بعض عشرات أقل من أو يساوي ثلاثة التنبؤ بشكل موثوق بغياب منتصف إلى أعلى درجة المعوية GvHD المرتبطة gvHD التهاب الدرجات القولونية التي تم الحصول عليها من الدرجات الهدولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن شدة GvHD المعوية المقدرة بالمنظار تظهر ارتباطًا مع نشاط مرض GvHD الجهازي. لتوحيد نتائج التقييم بالمنظار المصغر لالتهاب القولون وضمان قابلية المقارنة عبر الفئران المختلفة والتجارب مع مرور الوقت ، يجب اختيار موقع تشريحي محدد للتسجيل.
بالإضافة إلى تسجيل التهاب القولون، تسمح قناة العمل المدمجة داخل الإعداد بالمنظار المصغر باسترجاع خزعات الأنسجة الموجهة للعرض التي تنطبق على تحليلات المصب المختلفة، مثل علم الأنسجة المعياري. نظرًا للطبيعة غير الغازية للتنظير المصغر ، يمكن تقييم التهاب القولون الحاد المرتبط بـ GvHD مرارًا وتكرارًا داخل نفس الحيوان في أي وقت تقريبًا ، مما يؤدي إلى رؤى رائعة في GvHD المعوي.
