La evaluación minidoscópica del colon en ratones vivos proporciona un apoyo experimental clave para investigar las manifestaciones intestinales de la enfermedad aguda de gráfico contra huésped, GvHD, sobre el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. La evaluación no invasiva de la colitis aguda relacionada con la GvHD puede funcionar como un sustituto de trabajo de la histopatología estándar del oro, lo que hace innecesarios sacrificios animales repetidos para obtener especímenes de tejido. Demostrando el procedimiento estará Vera Buchele, una post-doc de mi laboratorio.
Un día después de la irradiación total del cuerpo de los ratones BALB/c receptores, coloque un ratón donante 5B6 SJL vivo de CD-45.1 en la posición propensa sobre una funda de trabajo limpia, y use una punta curvada y serrada de 13 cm de un fórceps de simkin para levantar el pelaje en un talón de Aceshill. Usando tijeras finas endurecidas de 8,5 cm con puntas rectas, incitar la piel entre los fórceps y un talón, alargando la incisión cranialmente para facilitar la eliminación de la piel y el pelaje de las extremidades posteriores. Cuando la piel se haya quitado de las extremidades posteriores, corte cada articulación de la cadera, el tobillo y la rodilla.
Almacene el muslo y el vástago de cada extremidad posterior en un único plato de Petri de 92 mm lleno de PVS sobre hielo y retire cuidadosamente tanto músculo como sea posible de cada hueso, transfiriendo cada fémur y tibia limpiados a un tubo de 50 ml de RPMI estéril 1640 medio sobre hielo húmedo. Para aislar la médula ósea, transfiera un hueso a la vez a un nuevo plato de Petri de 92 ml lleno de RPMI 1640 medio fresco, y use un bisturí para cortar los extremos de cada hueso. A continuación, utilice una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 26 para lavar los huesos con 1 ml de medio fresco a la vez en un tubo de recogida de 50 ml que contenga 5 ml de medio.
Cuando todos los huesos han sido lavados, pipetee suavemente las piezas de médula ósea de migas varias veces para generar una suspensión de una sola célula antes de filtrar las células a través de un colador de células de malla de malla de 40 micrómetros en un nuevo tubo de recolección de 50 ml. Pelecila las células por centrifugación y vuelva a suspender las células en 5 ml de tólizar de lyis potán de cloruro de amonio para una incubación de tres minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, detenga la reacción con 10 ml de PVS y centrifugar las células de nuevo.
Vuelva a suspender el pellet en 2 ml de PVS fresco para el recuento, y reserve una alícuota de seis veces 10 a la sexta célula para el análisis citométrico de flujo descendente. A continuación, utilice un kit de purificación celular disponible comercialmente para agotar magnéticamente las células T CD90.2 positivas de la suspensión de una sola célula de médula ósea, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y reservar una de cada 10 a la sexta alícuota celular del eluido de células T agotado para el análisis citométrico de flujo descendente de la pureza y composición de la célula antes y después de la separación. Luego, utilice una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 30 para inyectar cinco veces 10 a las quintas células de médula ósea agotadas por células T en 100 microlitros de PVS por vía intravenosa en el espacio retrobulbar del seno venoso de cada animal receptor irradiado.
Al día siguiente, coloque un bazo cosechado de un animal donante en un colador de malla de 40 micrómetros en un tubo de recolección de 50 ml, y utilice un émbolo de jeringa para presionar el tejido del bazo a través del colador en el tubo. Lavar el colador y el émbolo con PVS para recoger todos los esplocitos, y peletizar las células por centrifugación. Después de demostrar la lelisis de glóbulos rojos, vuelva a suspender los glóbulos blancos para el recuento y reserve una seis veces 10 a la sexta celda alícuota para el análisis citométrico de flujo descendente.
Para un aislamiento total de células T CD3 positivas del total de esplenocitos, utilice un kit de purificación celular disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y reserve una alícuota de células T de una por 10 a la sexta alícuota de células T CD3 positivas de la fracción celular positiva para el análisis citométrico de flujo descendente de la pureza y composición de la célula antes y después de la separación. Luego, inyecte siete veces 10 a las quintas células T aloreactivas CD3 positivas en 100 microlitros de PVS por vía intravenosa en el espacio de la barra retrobulbar de cada ratón receptor para inducir la GvHD. Para puntuar lesiones relacionadas con la GvHD mediante mini-endoscopia de la región colorrectal distal, levante la cola de un animal receptor justo por encima de la raíz de la cola con una mano, y use la otra mano para insertar cuidadosamente el endoscopio en el recto a través del ano.
Mientras la corriente de aire infla el lumen colorrectal, mueva lentamente y cuidadosamente el endoscopio hacia adelante en la dirección aboral. Para evitar lesiones intestinales en el colon, mantenga el endoscopio en la zona media del lumen usando la pantalla de video en vivo para ayudar en este posicionamiento. Comience a grabar la secuencia de vídeo y a puntuar la inflamación, evaluando la inflamación relacionada con GvHD del colon mediante la puntuación de los parámetros como se ilustra.
Cuando se haya localizado un punto de puntuación, mueva el endoscopio suavemente y ligeramente hacia adelante y hacia atrás para evaluar los diferentes parámetros. Para evaluar la translucidez del parámetro y la consistencia de las heces, coloque el endoscopio a una distancia más amplia en relación con la pared colónica. Para evaluar la granularidad y vascularidad de la lesión, coloque el endoscopio en la proximidad cercana a la pared colónica y aplique cuidadosamente tensión bien dosificada a la pared colónica con la punta del endoscopio.
Una vez completado el proceso de puntuación, detenga la grabación. En comparación con los controles, el trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas como se ha demostrado produce una inducción reproduciblemente robusta de un fenotipo GvHD sistémico, con un aumento progresivo de las puntuaciones clínicas de GvHD en animales receptores. Estos criterios mini-endoscópicamente evaluables se adaptaron específicamente de la colitis singénea previamente notificada en el contexto de parámetros de puntuación de colitis basados en la alo response para la descripción, puntuación y calificación precisas de lesiones asociadas a la enfermedad de GvHD intestinal en el colon distal.
De hecho, el sistema de clasificación basado en minidoscópicamente permite una fácil discriminación de los ratones receptores de donantes-linfocitos con signos graves de inflamación intestinal de ratones de control que están esencialmente desprovistos de GvHD. Invalidación del sistema de clasificación minidoscópicamente basado en estudios histopatológicos confirmó que el colon de ratones gravemente afectados por la inflamación relacionada con la GvHD muestra signos histopatológicos igualmente fuertes de inflamación. Por el contrario, los tejidos de colon de los ratones de control mostraron que no se producen, como máximo, signos histopatológicos leves de inflamación, de acuerdo con la ausencia virtual de signos de colitis miniendoscópicamente detectables.
Además, los estudios de correlación entre la actividad de colitis evaluada en minidoscópica e histopatológicamente y las puntuaciones sistémicas de GvHD demuestran que las puntuaciones de inflamación colónica asociadas a la GvHD de grado medio a superior se obtienen de la gradación histopatológica. Además, la gravedad de la GvHD intestinal evaluada endoscópicamente muestra una correlación con la actividad sistémica de la enfermedad por hección de televisión por asalariado. Para estandarizar los resultados de la evaluación minidoscópica de la inflamación colónica y garantizar la comparabilidad entre diferentes ratones y experimentos a lo largo del tiempo, se debe seleccionar un sitio anatómico definido para la puntuación.
Además de puntuar la inflamación colónica, el canal de trabajo incorporado dentro de la configuración minidoscópica permite la recuperación de biopsias de tejido guiadas por visión aplicables a diversos análisis posteriores, como la histopatología estándar. Debido a la naturaleza no invasiva de la mini-endoscopia, la colitis aguda relacionada con la GvHD se puede evaluar repetidamente dentro del mismo animal en prácticamente cualquier momento, lo que produce información fascinante sobre la GvHD intestinal.
