xCELLigence анализ клеток в режиме реального времени позволяет количественно контролировать убийство раковых клеток иммунными клетками в условиях, свободных от этикеток, и в течение нескольких дней. Эта система обеспечивает полный курс времени убийства раковых клеток, позволяющий одновременно скрининг большого количества конструкций, типов клеток-эффекторов, или комбинированной терапии при низком эффекторе к целевым соотношениям. Начните с посева 1,5 раза 10 до семи HEK293FT клеток в DMEM культуры среды в 150 миллилитров клеточной культуры блюдо для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с влажностью.
На следующее утро смешайте 2,5 миллилитров раствора для разбавления трансфекции, дополненную пятью микрограммами плазмидной ДНК лентивирусного вектора и 22,5 микрограммами лентивирусной упаковочной смеси с 82,5 микролитров трансинфекционные реагенты в 2,5 миллилитров раствора для разбавления трансфекции. После 15-минутной инкубации при комнатной температуре, передача реакции падение мудрым в блюдо HEK293FT клеток и вернуть клетки в инкубатор на секунду ночь инкубации. На следующее утро замените супернатант на 19 миллилитров свежей среды культуры DMEM и верните клетки в инкубатор на ночь.
Соберите супернатант в одну 50 миллилитровую коническую трубку для хранения четырех градусов по Цельсию в течение следующих двух дней, прежде чем осадки лентивируса центрифугации на второе утро, с тем чтобы удалить любые клетки или мусора из раствора. Перенесите все, кроме одного миллилитра лентивируса, содержащего супернатант, в сверхчистую центрифугу для ультрацентрифугации. После ультрацентрифугации, тщательно аспирировать остаточный вирус, содержащий супернатант, аккуратно добавить 100 микролитров DMEM к грануле, и поместить трубку на лед в течение 15 минут.
В конце инкубации аккуратно смешайте раствор и процитировать раствор лентивируса в предварительно охлажденные стерильные трубки для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Затем определите рейтер лентивируса по количественным RT-PCR в соответствии с инструкциями производителя. Для генерации и расширения клеток CAR-T активируйте от одного до двух раз от 10 до шести моноядерных клеток периферической крови в одном миллилитре среды клеток CAR-T с равным количеством микроволокна с покрытием CD3/CD28 в одном колодец 24-хорошо пластины в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 часов.
Следующие два утра, смешать один микролитер трансдуктора усилителя трансдукции агента с клетками, а затем добавление лентивируса при множественности инфекции пять к одному. Мониторинг роста Т-клеток каждые два-три дня, добавляя свежие CAR-T клеточной среды по мере необходимости для поддержания клеток в один-два раза от 10 до шести клеток на миллилитр концентрации. Для обнаружения экспрессии Т-клеток CAR по цитометрии потока, перенесите три раза 10 на пятый CAR и непереведенные Т-клетки в отдельные 1,5 миллилитровые микроцентрифуги.
Соберите клетки путем центрифугации и повторного перерасхода гранул в 200 микролитров буфера FACS дополнены 1%человеческой сыворотки. Разделите каждый образец клетки на 100 микролитров алицитов в отдельных пятими миллилитровых полистирола FACS труб на льду. Через пять минут добавьте один микролитер биотинилированных фрагментов FAB2 козьего противомошашки FAB2 в одну трубку каждого типа клеток и два микролитров антитела к другой трубке каждого типа клеток с тщательным смешиванием.
После 30 минут на льду, мыть клетки с тремя миллилитров свежего буфера FACS и после центрифугирования деканат супернатантов. Повторное добавление гранул в оставшийся супернатант и добавить два микролитров APC анти-CD3 и два микролитров 7-AAD для каждой трубки. Добавьте один микролитер с маркировкой PE Streptavidin с кратким смешиванием в трубку, окрашенную анти-FAB2 антителами и инкубировать все трубки на льду в течение 30 минут.
В конце инкубации проанализируйте клетки по цитометрии потока в соответствии со стандартными протоколами, загоняя Т-клетки вперед по сравнению с боковым рассеянием и CD3 против экспрессии 7-AAD. Для анализа потенции цитолитоза в режиме реального времени добавьте от 50 до 100 микролитров среды культуры целевых клеток к каждому колодец электронной пластины и измерьте фоновое неровность в инструменте анализатора клеток. Обнаружить целевые раковые клетки из пластины культуры с помощью трипсина.
Вымойте клетки в 15 миллилитров свежей среды культуры и центрифуги. Переусейте гранулы раковых клеток в пяти миллилитров свежей среды для подсчета и настроить плотность клеток к соответствующей концентрации целевых клеток. Добавьте клетки в соответствующее количество колодцев и оставьте электронную пластину на 30 минут при комнатной температуре, чтобы клетки равномерно оседают на дне колодцев.
В конце периода эквилибрации поместите пластину в анализатор клеток в режиме реального времени и автоматически инициируйте измерение имплеанса каждые 15 минут на ночь. Адгезия и распространение целевых ячеек можно отслеживать в режиме реального времени. На следующее утро разбавить эффектор CAR и контролировать Т-клетки до соответствующей концентрации в отдельных трубках и удалить от 50 до 100 микролитров из каждой колодец электронной пластины, так что окончательный объем в каждой хорошо составляет 100 микролитров.
Далее семенной эффектор и контроль Т-клеток в соответствующих скважинах при соответствующем эффекторе к целевым соотношениям в 100 микролитров среднего на скважину. Затем эквилибрируйте электронную пластину в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем вернуть пластину в систему анализатора клеток. Для измерения эффективности Т-клеток опосредовано убийство целевых раковых клеток, контролировать CAR-T опосредованное убийство в течение 96 часов.
Около 50% клеток CAR-T, окрашенных положительно для анти-одной цепи переменных фрагментов антител, указывающих на экспрессию ЦАР примерно в 50% Т-клеток. В этом репрезентативном эксперименте для всех групп использовалось соотношение 10 к одному и целевому показателю. Раджи клетки только и CD22-CAR Т-клеток лечение Raji клетки отображаются значительные убийства по сравнению с контролем Т-клеток только и Mock CAR-T клеточных групп.
В этом эксперименте, только CD47-CAR-T клетки были эффективны в убийстве раковых клеток поджелудочной железы. Кроме того, сигнал о неуступности только от клеток CD47-CAR-T был лишь немного выше сигнала индекса клетки, измеренного только в средних колодцах, указывающих на то, что сигнал о неуступности в результате подвесных клеток, таких как клетки CAR-T, минимален и не способствует общему сигналу о неприступности, когда клетки CAR-T добавляются в раковые клетки цели. Примечательно, что GITR состимуляторного домена было отмечено, чтобы быть более эффективным в повышении CAR-T клеточного убийства против эпителиального фактора роста рецепторов положительных целевых клеток по сравнению с оригинальными конструкций ЦАР без домена GITR.
Среда из скважин электронной пластины может быть собрана для анализа профиля цитокинов в точках времени во время или после анализа в соответствии с потребностями эксперимента. В целом, xCELLigence повысил эффективность оценки потенции различных иммунотерапии, начиная от двухспецифических Т-клеток и онколитических вирусов до ингибиторов иммунной точки проверки в комбинированной терапии.
