Наш лабораторный протокол позволяет сочетать редактирование генома человека с CAR T-клеточной терапией. Лабораторная процедура представляет подход с ПОМОЩЬЮ CRISPR-Cas9 к нацеливаниям до трех генов с высокой эффективностью. И, наконец, наш подход может быть переведен в клинические испытания на людях.
Описанные методы могут быть применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням. Основа методов достаточно надежна, чтобы быть переведенной в более широкий масштаб и академическим и отраслевым сотрудникам для дальнейшего развития. При первой попытке применения этого протокола ограничьте количество групп на экране направляющей РНК, чтобы обеспечить точное время инкубации.
Соблюдение условий культуры и плотности посева, как описано, оказалось критически важным в нашем опыте. Для начала получите аутологичные мононуклеарные клетки периферической крови, или PBMCs, от здоровых доноров-добровольцев и выделите CD4 и CD8 положительные Т-клетки, используя коммерчески доступные наборы для селекции CD4 и CD8. Объедините CD4-положительные и CD8-положительные Т-клетки в соотношении один к одному и инкубируйте 3 миллиона клеток на миллилитр в R10, дополненные 5 нанограммами на миллилитр каждого человеческого IL7 и человеческого IL15 в течение ночи при 37 градусах Цельсия.
На следующий день подсчитайте Т-клетки и центрифугу от 5 до 10 миллионов клеток в 300 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от всего супернатанта и промыть гранулы клеток в восстановленной сыворотке минимально необходимой среды. Повторно суспензируйте гранулу в 100 микролитрах раствора для ядерного поражения в соответствии с инструкциями производителя.
Во время промывания клеток готовят рибонуклеопротеин, или комплекс RNP, путем инкубации 10 мкг нуклеазы Cas9 с 5 мкг одноповодной РНК в течение 10 минут при комнатной температуре. Включите макет управления без единой направляющей РНК. Объедините повторно взвешенные ячейки с комплексом RNP и добавьте 4,2 микролитра четырех микромолярных усилителей электропорации.
Хорошо перемешать и переложить в электропорационные кюветы. Электропорировать клетки, используя импульсный код EH111, затем инкубировать 5 миллионов клеток на миллилитр в R10, дополненных 5 нанограммами на миллилитр человеческого IL7 и человеческим IL15 при 30 градусах Цельсия в течение 48 часов в 12 пластинах скважины. После инкубации приступайте к активации и расширению Т-клеток.
Разработайте секвенирование грунтовок, введя последовательность ампликона ПЦР в стандартное программное обеспечение для проектирования грунтовок. Программное обеспечение для проектирования предложит несколько последовательностей праймеров, которые подходят для секвенирования Сэнгера. Выбирайте прямую и обратную праймеры, которые связывают с ампликоном не менее 150 пар оснований вверх или вниз по течению от участка разреза гРНК, чтобы обеспечить хорошее качество секвенирования вокруг инделей.
Используйте анализ TIDE для определения эффективности нокаута на геномном уровне. Алгоритм точно реконструирует спектр инделей из трассировок последовательности и вычисляет значения квадрата R. После активации Т-клетки расширяют в культуре и криоконсервируют для будущих исследований.
Во время расширения удвоение популяции и изменения объема отслеживаются по всему протоколу как для имитации, так и для отредактированных Т-клеток CAR. Никаких существенных изменений в распространении и активации во время расширения обнаружено не было. После того, как клетки были криоконсервированы, уровни экспрессии CAR были определены для дальнейших функциональных исследований как для макета отредактированных, так и для нокаутированных Т-клеток CAR.
Существенных изменений не наблюдалось. Эффективность нокаута может быть определена с помощью нескольких методов. На этих репрезентативных участках проточной цитометрии локусы PDCD1 и TRAC были нацелены с использованием одной направляющей РНК, показав эффективность 90% для одноводной РНК PDCD1 и 98% для одноводной РНК TRAC у нескольких здоровых доноров.
Важно убедиться, что молярные соотношения Cas9 и направляющих РНК являются точными. Во время процедуры клетки всегда должны храниться при четырех градусах Цельсия и не должны оставаться в растворе электропорации в течение длительных периодов времени. После сохранения CAR Сконструированные CRISPR Т-клетки CAR могут использоваться для функциональных анализов in vitro и in vivo, таких как анализы цитотоксичности, производство цитокинов и сингенетические или ксенографические модели опухолей мышей.
Наш подход с использованием технологии CRISPR Cas9 в настоящее время применяется в клинических испытаниях. Подход может быть использован как при раке, так и при нераковых генетических нарушениях, таких как гемоглобинофии, которые затрагивают миллионы детей и взрослых во всем мире.
