Этот метод может помочь ответить на spatiotemporal регуляции гена интереса во время динамических биологических событий, таких как иммунитет в нетронутых листьев арабидопсиса. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет зафиксировать spatiotemporal динамику промоутерской активности в почве, выращенной нетронутыми листьями растений в течение нескольких дней. Чтобы начать эту процедуру, заполните пластиковые ячейки штепсельной вилки лоток с автоклавом почвы.
Посеять одно трансгенное семя арабидопсиса в каждую клетку. Перенесите лоток в комнату роста, которая поддерживается при 23 градусах по Цельсию и выращивать растения в условиях непрерывного белого света в течение двух-трех недель. За два дня до прививки патогена, полоса патогена проведения avrRpt2 из глицерола на NYG среды, которая содержит рифампицин на 100 миллиграммов на литр и канамицин на 50 миллиграммов на литр.
Инкубировать при 28 градусах по Цельсию в течение 48 часов. Используя пластиковые наконечники, урожай бактериальных клеток, которые появляются на поверхности среды. Перенесите бактерии в пластиковую трубку, содержащую 10 миллимолярд хлорида магния, и ресуспенендуйте их.
Затем измерьте оптическую плотность раствора на уровне 600 нанометров. Отрегулируйте окончательную концентрацию бактериальных клеток до 100 миллионов единиц колонии, образующих единицы на миллилитр, что обычно соответствует OD600 из 0,2. Во-первых, тщательно вырезать ячейку штепсельную вилку, содержащую две-три недели завод убедившись, что не повредить растение.
Установите ячейку в пустой лоток для вилки ячейки, чтобы поддерживать хороший баланс. Выберите заметно здоровый лист для прививки. При этом, как правило, с третьим, четвертым и пятым листьями со дна растения легко справиться.
Поливать почву, удерживая растение перед прививкой для длительной покадровой визуализации. Дополнительно при анализе стрессоустойчивых промоутеров обследовать листья под стереомикроскопом флуоресценции до прививки патогена для проверки отсутствия сигнала YFP. Затем на надеть одноразовые латексные перчатки, чтобы избежать прямого контакта с патогеном во время инфильтрации.
Используя одноми миллилитр без иглы пластиковый шприц, тщательно проникают абаксиальной стороне листа с бактериальной суспензией. Прививка небольшой порции на половине листа позволяет хорошо визуализировать активность промоутера PR1. Используйте мягкое бумажное полотенце, чтобы поглотить излишки бактериальной суспензии из области, окружающей проникли области на проникли листьев.
Сразу после прививки используйте хирургическую ленту, чтобы зафиксировать стеклянную горку к пластиковому подносу, чтобы проникший лист располагался в центре стеклянной горки. Убедитесь, что привитое лезвие листа полностью установлено в стеклянной горке. Разрежьте кусок двухслойной пластиковой ленты на две части, чтобы соответствовать пространствам вдоль петиола проникли листьев, и вырезать угол от каждого куска.
Используя пару тонких пинцетов, придерживаться этих кусков ленты по обе стороны от петиола так, что срезанные углы каждого куска выравниваются с основанием листа лезвия, убедившись, что кусочки ленты не касаются петиола или листа лезвия. Затем подготовьтесь к дополнительному куску двухслойной пластиковой ленты, изложенной на рисунке 2 текстового протокола. Stick этот кусок ленты на вершине ранее придерживались штук, чтобы сформировать мост через петиол, будьте осторожны, чтобы не поймать петиол или лист лезвие непосредственно между лентой штук.
Затем аккуратно вставьте небольшой кусочек хирургической ленты на стеклянную горку над кончиком листа лезвия так, чтобы он был зафиксирован очень мягко на слайде. Нажмите вниз твердо только на часть ленты, которая непосредственно касаясь стеклянной горки. Аккуратно поместите еще один небольшой кусок хирургической ленты на границе петиол и пластиковые кусочки ленты так, что петиол очень мягко крепится как на стеклянную горку, так и на кусочки пластиковой ленты, убедившись, что только прочно прикрепить часть хирургической ленты, которая непосредственно касается стеклянной горки или пластиковых частей ленты.
Вставьте 200 микролитровых пипеток советы осторожно в почву, чтобы аккуратно держать соседние листья от проникли листьев. Первый поворот на флуоресцентный стереомикроскоп. Установите растение в пространство под объективом стереомикроскопа для визуализации.
Настройка параметров для изображений замедленного действия. Используйте обычный фильтр YFP для визуализации сигнала YFP. Используйте техасский красный фильтр для визуализации автоматического флюоресценции хлорофилла, чтобы домен PCD был виден как темная область, окруженная YFP-положительными слоями клеток.
Далее используйте обычные эпи-яркие настройки поля для дополнительных шагов воздействия света, убедившись, что программа шаги для воздействия света в течение интервального периода промежуток времени изображения, как свет имеет большое влияние на иммунитет растений. Запустите программу по визуализации замедленного действия. Для длительного наблюдения в течение нескольких дней, рассмотреть полив завода надлежащим образом.
После получения изображения опустить дополнительные каналы, используемые для воздействия света в интервалах от набора данных. Используя программное обеспечение для анализа изображений, анализируйте данные с помощью различных методов, таких как анализ региона интересов. В этом исследовании, универсальный метод демонстрируется для монтажа арабидопсиса листья для интравитальной замедленной визуализации.
Репрезентативный пример данных замедленного изображения с использованием avrRpt2 индуцированной ETI получен как серия изображений, так и как покадровой фильм. В успешных экспериментах с использованием pPR1-YPF-NLS во время avrRpt2 индуцированной ETI наблюдается переходная активация PR1 промоутера, о чем свидетельствует YFP, выражающем очаги и несколько слоев ячеек, окружающих домен PCD. Активация PR1 промоутер в клетках, окружающих домен PCD обычно начинается примерно в пять часов после прививки, пики примерно в 12 часов после прививки и длится до 40 часов после прививки.
При попытке проведения этой процедуры необходимо тщательно установить условия замедленного действия, как это описано в тексте. Следуя этой процедуре, промоутерская деятельность может быть проанализирована количественно и качественно, используя аналитическое программное обеспечение. Этот анализ помогает нам исследовать spatiotemporal динамику экспрессии генов в любом биологическом событии, происходящих в живых листьях растений арабидопсиса.
