Cette méthode peut aider à répondre à la régulation spatiotemporal d’un gène d’intérêt pendant l’événement biologique dynamique tel que l’immunité dans les feuilles intactes d’arabidopsis. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de capturer la dynamique spatiotemporale de l’activité du promoteur dans le sol cultivé feuilles de plantes intactes sur quelques jours. Pour commencer cette procédure, remplissez un plateau de bouchons à cellules plastiques avec du sol autoclavé.
Semer une graine d’arabidopsie transgénique dans chaque cellule. Transférer le plateau dans une salle de croissance qui est maintenue à 23 degrés Celsius et faire pousser les plantes dans des conditions de lumière blanche continue pendant deux à trois semaines. Deux jours avant l’inoculation des pathogènes, stries de l’agent pathogène transportant avrRpt2 à partir d’un stock de glycérol sur le milieu NYG qui contient de la rifampicine à 100 milligrammes par litre et la kanamycine à 50 milligrammes par litre.
Incuber à 28 degrés Celsius pendant 48 heures. À l’aide de pointes en plastique, récolter les cellules bactériennes qui apparaissent à la surface du milieu. Transférer les bactéries dans un tube en plastique contenant du chlorure de magnésium de 10 millimaux et les résuspendre.
Mesurez ensuite la densité optique de la solution à 600 nanomètres. Ajuster la concentration finale des cellules bactériennes à 100 millions d’unités de formation de colonies par millilitre, ce qui correspond normalement à un OD600 de 0,2. Tout d’abord, découpez soigneusement une prise cellulaire contenant une plante vieille de deux à trois semaines en vous assurant de ne pas endommager l’usine.
Placez la cellule dans un plateau vide pour maintenir un bon équilibre. Choisissez une feuille visiblement saine pour l’inoculation. Notant qu’en général, les troisième, quatrième et cinquième feuilles du fond de la plante sont faciles à manipuler.
Arrosez le sol en tenant la plante avant l’inoculation pour l’imagerie à long terme time-lapse. En option, lors de l’analyse des promoteurs sensibles au stress examiner les feuilles sous un stéréomicroscope de fluorescence avant l’inoculation pathogène pour vérifier l’absence de signal YFP. Ensuite, mettez des gants jetables en latex pour éviter tout contact direct avec l’agent pathogène pendant l’infiltration.
À l’aide d’une seringue en plastique sans aiguille d’un millilitre, infiltrez soigneusement le côté abaxial de la feuille avec la suspension bactérienne. L’inoculation d’une petite partie sur la moitié de la feuille permet une bonne visualisation de l’activité du promoteur PR1. Utilisez une serviette en papier souple pour absorber tout excès de suspension bactérienne de la zone entourant la zone infiltrée sur la feuille infiltrée.
Immédiatement après l’inoculation, utilisez du ruban chirurgical pour fixer une glissière en verre sur le plateau en plastique de sorte que la feuille infiltrée soit située au centre de la glissière de verre. Assurez-vous que la lame de feuille inoculée est complètement ajustée dans la glissière en verre. Couper un morceau de ruban plastique à double couche en deux morceaux pour s’adapter aux espaces le long du pétiole de la feuille infiltrée, et couper un coin de chaque pièce.
À l’aide d’une paire de pinces fines, collez ces morceaux de ruban adhésif de chaque côté du pétiole de sorte que les coins coupés de chaque pièce s’alignent avec la base de la lame de feuille, en s’assurant que les morceaux de ruban ne touchent pas le pétiole ou la lame de feuille. Préparez ensuite un morceau supplémentaire de ruban plastique à double couche tel qu’il est décrit dans la figure deux du protocole du texte. Collez ce morceau de ruban adhésif sur les pièces précédemment adhérentes pour former un pont sur le pétiole, en prenant soin de ne pas attraper le pétiole ou la lame de feuille directement entre les morceaux de ruban adhésif.
Collez ensuite délicatement un petit morceau de ruban chirurgical sur la glissière de verre au-dessus de la pointe de la lame de feuille de sorte qu’elle soit fixée très doucement sur la glissière. Appuyez fermement uniquement sur la partie de la bande qui touche directement la glissière de verre. Placez délicatement un autre petit morceau de ruban chirurgical sur la bordure du pétiole et des morceaux de ruban plastique de sorte que le pétiole soit très doucement fixé sur la glissière de verre et les morceaux de ruban adhésif en plastique, en s’assurant de fixer fermement seulement fermement la partie du ruban chirurgical qui touche directement la glissière en verre ou les morceaux de ruban en plastique.
Insérez 200 tuyaux de microlitres dans le sol pour tenir doucement les feuilles voisines à l’écart de la feuille infiltrée. Allumez d’abord le stéréomicroscope fluorescent. Placez la plante dans l’espace sous l’objectif du stéréomicroscope pour l’imagerie.
Configurez les paramètres de l’imagerie en accéléré. Utilisez le filtre YFP conventionnel pour visualiser le signal YFP. Utilisez le filtre Texas Red pour visualiser l’autofluorescence chlorophylle afin que le domaine pcd soit visible comme une zone sombre entourée de couches cellulaires positives au YFP.
Ensuite, utilisez la configuration conventionnelle du champ épi-lumineux pour des étapes supplémentaires d’exposition à la lumière, en s’assurant de programmer des étapes pour l’exposition à la lumière pendant la période d’intervalle de l’imagerie time-lapse que la lumière a un impact majeur sur l’immunité des plantes. Exécutez le programme d’imagerie time-lapse. Pour une observation à long terme sur plusieurs jours, envisagez d’arroser la plante de façon appropriée.
Après l’acquisition de l’image, omettez les canaux supplémentaires utilisés pour l’exposition à la lumière dans les intervalles de l’ensemble de données. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, analyser les données à l’aide de diverses méthodes, telles que l’analyse de la région d’intérêt. Dans cette étude, une méthode polyvalente est démontrée pour le montage des feuilles d’arabidopsis pour l’imagerie intravitale de time-lapse.
Un exemple représentatif de données d’image time-lapse utilisant avrRpt2 induite ETI est obtenu à la fois comme une série d’images et comme un film time-lapse. Dans les expériences réussies utilisant pPR1-YPF-NLS pendant l’ETI induite par avrRpt2, l’activation passagère du promoteur pr1 est observée, comme évident de YFP exprimant des foyers et plusieurs couches de cellules entourant le domaine de PCD. L’activation du promoteur PR1 dans les cellules entourant le domaine pcd commence généralement à environ cinq heures après l’inoculation, culmine à environ 12 heures après l’inoculation et dure jusqu’à 40 heures après l’inoculation.
Lors de la tentative de cette procédure, les conditions de time-lapse doivent être établies avec soin comme décrit dans le texte. Suivant cette procédure, l’activité du promoteur peut être analysée quantitativement et qualitativement, à l’aide d’un logiciel d’analyse. Ces analyses nous aident à explorer la dynamique spatiotemporale de l’expression des gènes dans tout événement biologique se produisant dans les feuilles vivantes des plantes arabidopsis.
