يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على التنظيم الزماني الزئيكي لجين من الاهتمام خلال الحدث البيولوجي الديناميكي مثل الحصانة في أوراق arabidopsis سليمة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بالتقاط الديناميات الزمانية الزقتية لنشاط المروج في التربة التي تزرع أوراق النباتات السليمة على مدى أيام قليلة. لبدء هذا الإجراء، تعبئة علبة القابس من البلاستيك مع التربة ذات التكفا.
زرع بذور أرابيدوبسيس واحدة المعدلة وراثيا في كل خلية. نقل علبة إلى غرفة النمو التي يتم الحفاظ عليها في 23 درجة مئوية وتنمو النباتات في ظل ظروف الضوء الأبيض المستمر لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. قبل يومين من التطعيم الممرض، streak الممرض تحمل avrRpt2 من مخزون الجلسرين على متوسطة NYG التي تحتوي على ريفامبيسين في 100 ملليغرام للتر الواحد وkanamycin في 50 ملليغرام للتر الواحد.
احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. باستخدام النصائح البلاستيكية، حصاد الخلايا البكتيرية التي تظهر على سطح المتوسطة. نقل البكتيريا إلى أنبوب بلاستيكي يحتوي على كلوريد المغنيسيوم 10 ملليمولر وإعادة الاعتماد عليها.
ثم قياس الكثافة البصرية للحل في 600 نانومتر. ضبط التركيز النهائي للخلايا البكتيرية إلى 100 مليون مستعمرة تشكيل وحدات لكل ملليلتر الذي يتوافق عادة إلى OD600 من 0.2. أولا، قطع بعناية قابس الخلية التي تحتوي على مصنع من عمر أسبوعين إلى ثلاثة مع التأكد من عدم إلحاق الضرر النبات.
تعيين الخلية في علبة توصيل خلية فارغة للحفاظ على توازن جيد. حدد ورقة صحية واضحة لللقح. مع الإشارة إلى أنه من السهل التعامل مع الأوراق الثالثة والرابعة والخامسة من قاع المصنع بشكل عام.
المياه التربة عقد النبات قبل التطعيم للتصوير الفاصل الزمني على المدى الطويل. اختياريا، عند تحليل المروجين استجابة الإجهاد فحص الأوراق تحت مضان منظار مجسم مسيل قبل تلقيح الممرض للتحقق من عدم وجود إشارة YFP. المقبل، وضعت على قفازات اللاتكس المتاح لتجنب الاتصال المباشر مع الممرض أثناء التسلل.
باستخدام حقنة بلاستيكية بدون إبرة من المليلتر ، تتسلل بعناية إلى الجانب الأباكسالي من الورقة مع التعليق البكتيري. التطعيم جزء صغير على نصف ورقة تمكن التصور جيدة من نشاط المروج PR1. استخدام منشفة ورقية ناعمة لامتصاص أي تعليق جرثومي زائد من المنطقة المحيطة بالمنطقة المتسللة على ورقة مخترقة.
مباشرة بعد التلقيح، واستخدام الشريط الجراحي لإصلاح شريحة زجاجية إلى علبة بلاستيكية بحيث يتم وضع ورقة تسلل في وسط الشريحة الزجاجية. تأكد من أن شفرة ورقة مطعّم يتم تركيبها تماما داخل الشريحة الزجاجية. قطع قطعة من الشريط البلاستيكي مزدوج الطبقات إلى قطعتين لتناسب المساحات على طول بيتيول ورقة مخترقة، وقطع زاوية قبالة كل قطعة.
باستخدام زوج من ملاقط غرامة، عصا هذه القطع من الشريط على جانبي petiole بحيث زوايا قطع من كل قطعة محاذاة مع قاعدة شفرة ورقة، والتأكد من أن قطع الشريط لا تلمس بيتولي أو شفرة ورقة. المقبل إعداد قطعة إضافية من الشريط البلاستيك مزدوج الطبقات كما هو موضح في الشكل الثاني من بروتوكول النص. عصا هذه القطعة من الشريط على رأس القطع التي تم الالتزام بها سابقا لتشكيل جسر فوق petiole، مع الحرص على عدم التقاط شفرة صغيرة أو ورقة مباشرة بين قطع الشريط.
ثم عصا بلطف قطعة صغيرة من الشريط الجراحي على الشريحة الزجاجية فوق غيض من شفرة ورقة بحيث يتم إصلاحها بهدوء جدا على الشريحة. اضغط باستمرار على الجزء من الشريط الذي يلمس الشريحة الزجاجية مباشرةً. ضع بلطف قطعة صغيرة أخرى من الشريط الجراحي على حدود قطع الشريط الصغير والبلاستيك بحيث يتم إصلاح الـ petiole بشكل ناعم جدًا على كل من الشريحة الزجاجية وقطع الشريط البلاستيكي ، مع التأكد من إرفاق جزء الشريط الجراحي الذي يلمس الشريحة الزجاجية أو قطع الشريط البلاستيكي بشكل ثابت.
إدراج 200 نصائح ماصة ميكرولتر بلطف في التربة لعقد بلطف الأوراق المجاورة بعيدا عن ورقة تسللت. أول بدوره على منظار الميكروكروسكوب الفلورسنت. تعيين النبات في الفضاء تحت عدسة الهدف من stereomicroscope للتصوير.
إعداد المعلمات للتصوير الفاصل الزمني. استخدم عامل تصفية YFP التقليدي لتصور إشارة YFP. استخدم فلتر تكساس ريد لتصور الفلورورات التلقائية الكلورو بحيث يكون مجال PCD مرئيًا كمنطقة مظلمة محاطة بطبقات خلايا إيجابية YFP.
بعد ذلك استخدام الإعداد المجال الضوئية التقليدية لتعرض الضوء خطوات إضافية، مع التأكد من خطوات البرنامج للتعرض للضوء خلال الفترة الفاصلة من التصوير الفاصل الزمني كما ضوء له تأثير كبير على مناعة النبات. تشغيل برنامج التصوير الفاصل الزمني. لمراقبة طويلة الأجل على مدى عدة أيام، والنظر في سقي النبات بشكل مناسب.
بعد الحصول على الصورة، حذف القنوات الإضافية المستخدمة للتعرض للضوء في الفواصل الزمنية من مجموعة البيانات. باستخدام برنامج تحليل الصور، تحليل البيانات مع أساليب مختلفة، مثل منطقة من مصلحة تحليل. في هذه الدراسة، هو التدليل على طريقة متعددة لتركيب أوراق arabidopsis للتصوير الفاصل الزمني داخل مدينة.
مثال تمثيلي لبيانات صورة الفاصل الزمني باستخدام avrRpt2 المستحث ETI يتم الحصول عليه كسلسلة من الصور و الفيلم الفاصل الزمني. في التجارب الناجحة باستخدام pPR1-YPF-NLS أثناء ETI الناجم عن avrRpt2، لوحظ التنشيط العابر للمروج PR1، كما هو واضح من YFP التعبير عن بؤر والعديد من طبقات الخلايا المحيطة بمجال PCD. يبدأ تنشيط مُروج PR1 في الخلايا المحيطة بمجال PCD عادةً في حوالي خمس ساعات بعد التلقيح، وتبلغ ذروته في حوالي 12 ساعة بعد التطعيم ويستمر حتى 40 ساعة بعد التلقيح.
وعند محاولة هذا الإجراء، يلزم أن تحدد بدقة شروط الفواصل الزمنية على النحو المبين في النص. بعد هذا الإجراء، يمكن تحليل نشاط المروج كما ونوعيا، وذلك باستخدام برامج التحليل. يساعدنا هذا التحليل على استكشاف الديناميات الزمانية الزقتية للتعبير الجيني في أي حدث بيولوجي يحدث في الأوراق الحية من نباتات أرابيدوبسيس.
