שיטה זו יכולה לעזור לענות על הרגולציה המרחבית של גן של עניין במהלך אירוע ביולוגי דינמי כגון חסינות בעלי arabidopsis שלמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו ללכוד את הדינמיקה spatiotemporal של פעילות האמרגן באדמה גדל עלים צמחיים שלמים על פני כמה ימים. כדי להתחיל בהליך זה, מלא מגש תקע תא פלסטיק באדמה אוטומטית.
זורעים זרע ערבי-ידידפוס מהוקרן אחד לכל תא. מעבירים את המגש לחדר צמיחה המתוחזק בטמפרטורה של 23 מעלות ומגדלים את הצמחים בתנאי תאורה לבנה רציפים למשך שבועיים עד שלושה שבועות. יומיים לפני חיסון פתוגן, פס הפתוגן נושא avrRpt2 ממלאי גליצרול על מדיום NYG המכיל ריפאמפיצין ב 100 מיליגרם לליטר ו kanamycin ב 50 מיליגרם לליטר.
דגירה ב 28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. באמצעות טיפים פלסטיים, לקצור את התאים החיידקיים המופיעים על פני השטח של המדיום. מעבירים את החיידקים לצינור פלסטיק המכיל 10 מילימולאר מגנזיום כלורי ולתלות אותם מחדש.
לאחר מכן למדוד את הצפיפות האופטית של הפתרון ב 600 ננומטר. התאם את הריכוז הסופי של תאי חיידקים ל-100 מיליון יחידות יוצרות מושבה למיליליטר, שבדרך כלל תואמות ל-OD600 של 0.2. ראשית, לחתוך בזהירות תקע תא המכיל צמח בן שבועיים עד שלושה שבועות הקפדה לא לפגוע במפעל.
הגדר את התא במגש תקע תא ריק כדי לשמור על איזון טוב. בחר עלה בריא בעליל לחיסון. שים לב כי בדרך כלל, השלישי, הרביעי, ואת העלים החמישית מתחתית הצמח קל לטפל.
להשקות את האדמה המחזיקה את הצמח לפני החיסון להדמיה לטווח ארוך. באופן אופציונלי, בעת ניתוח מקדמים מגיבים ללחץ לבחון את העלים תחת stereomicroscope פלואורסצנטי לפני חיסון פתוגן כדי לאמת את היעדר אות YFP. לאחר מכן, לשים על כפפות לטקס חד פעמיות, כדי למנוע מגע ישיר עם הפתוגן במהלך הסתננות.
באמצעות מזרק פלסטיק ללא מחט מיליליטר אחד, בזהירות לחדור את הצד abaxial של העלה עם ההשעיה חיידקי. חיסון של חלק קטן על מחצית העלה מאפשר הדמיה טובה של פעילות מקדם PR1. השתמש במגבת נייר רכה כדי לספוג כל השעיה חיידקית עודפת מהאזור המקיף את האזור הסתנן על העלה הסתנן.
מיד לאחר החיסון, השתמש בקלטת כירורגית כדי לתקן מגלשת זכוכית למגש הפלסטיק כך שהעלה הסתנן ממוקם במרכז מגלשת הזכוכית. ודא כי להב העלה מחוסן מצויד לחלוטין בתוך מגלשת הזכוכית. חותכים חתיכת סרט פלסטיק דו שכבתי לשני חלקים כדי להתאים את החללים לאורך הפטיול של העלה הסתנן, וחותכים פינה את כל חתיכה.
באמצעות זוג פינצטה עדין, לתקוע את חתיכות אלה של קלטת משני צדי petiole כך הפינות לחתוך של כל חתיכה ליישר עם הבסיס של להב העלה, לוודא כי חתיכות הסרט לא לגעת petiole או להב העלה. לאחר מכן הכינו קטע נוסף של סרט פלסטיק דו-שכבתי כמתואר איור 2 של פרוטוקול הטקסט. תקע את פיסת הקלטת הזו על החלקים שדבקו בעבר כדי ליצור גשר מעל הפטיול, תוך הקפדה לא לתפוס את הלהב הקטנוני או העלה ישירות בין חלקי הסרט.
ואז בעדינות לתקוע חתיכה קטנה של סרט כירורגי על החלקת הזכוכית מעל קצה להב העלה, כך שהוא קבוע ברכות רבה על שקופית. לחץ כלפי מטה בחוזקה רק על החלק של הקלטת כי הוא נוגע ישירות את שקופית הזכוכית. מניחים בעדינות עוד חתיכה קטנה של סרט כירורגי על גבול החלקים פטיול וקלטת פלסטיק, כך petiole הוא קבוע ברכות רבה הן על החלקים שקופית זכוכית סרט פלסטיק, הקפדה רק בחוזקה לחבר את החלק של הסרט כירורגי כי הוא נוגע ישירות את מגלשת הזכוכית או חתיכות סרט פלסטיק.
הכנס 200 טיפים פיפית microliter בעדינות לתוך האדמה בעדינות להחזיק את העלים השכנים מן העלה הסתנן. הפעל תחילה את הסטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי. הגדר את הצמח לחלל מתחת לעדשה האובייקטיבית של הסטריאומיקרוסקופ להדמיה.
כוונן את הפרמטרים עבור דימות זמן לשגות. השתמשו במסנן YFP הקונבנציונלי כדי להמחיש את אות ה- YFP. השתמש במסנן Texas Red כדי להמחיש שפעת אוטומטית של כלורופיל כך שתחום ה- PCD יהיה גלוי כאזור חשוך מוקף בשכבות תאים חיוביות ל- YFP.
לאחר מכן השתמש בהגדרת השדה האפי-בהיר הקונבנציונלי עבור שלבי חשיפה נוספים לאור, הקפד לתכנת שלבים לחשיפה לאור במהלך פרק הזמן של הדמיית זמן לשגות כמו אור יש השפעה גדולה על חסינות הצמח. הפעל את תוכנית ההדמיה של זמן לשגות. לתצפית ארוכת טווח על פני מספר ימים, שקול להשקות את הצמח כראוי.
לאחר רכישת תמונה, השמט ערוצים נוספים המשמשים לחשיפה לאור במרווחי הזמן של ערכת הנתונים. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, לנתח את הנתונים בשיטות שונות, כגון ניתוח אזור עניין. במחקר זה, שיטה רב-תכליתית מוכחת להרכבה של עלי arabidopsis להדמיה תוך-זמנית של זמן לשגות.
דוגמה מייצגת של נתוני תמונה לשגות זמן באמצעות ETI המושרה AvrRpt2 מתקבל הן סדרה של תמונות והן כסרט לשגות בזמן. בניסויים מוצלחים באמצעות pPR1-YPF-NLS במהלך ETI המושרה avrRpt2, הפעלה ארעית של מקדם PR1 נצפתה, כפי שניכר מ- YFP המבטא מוקדים וכמה שכבות של תאים המקיפים את תחום ה- PCD. ההפעלה של מקדם PR1 בתאים המקיפים את תחום PCD בדרך כלל מתחיל בערך חמש שעות לאחר חיסון, פסגות בערך 12 שעות לאחר חיסון ונמשך עד 40 שעות לאחר חיסון.
בעת ניסיון לבצע הליך זה, יש ליצור בקפידה את תנאי איבוד הזמן כמתואר בטקסט. בעקבות הליך זה, ניתן לנתח את פעילות האמרגן באופן כמותי ואיכותי, באמצעות תוכנת ניתוח. ניתוחים אלה מסייעים לנו לחקור את הדינמיקה המרחבית של ביטוי גנים בכל אירוע ביולוגי המתרחש בעלים חיים של צמחים ערבידופסיים.
