Questo metodo può aiutare a rispondere alla regolazione spaziotemporale di un gene di interesse durante eventi biologici dinamici come l'immunità nelle foglie di arabidopsis intatte. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ci permette di catturare le dinamiche spaziotemporali dell'attività promotrice nel terreno coltivato intatto foglie vegetali in pochi giorni. Per iniziare questa procedura, riempire un vassoio a spina di plastica con terreno autoclavato.
Seminare un seme di arabidopsis transgenico in ogni cellula. Trasferire il vassoio in una stanza di crescita che viene mantenuta a 23 gradi Celsius e far crescere le piante in condizioni continue di luce bianca per due o tre settimane. Due giorni prima dell'inoculazione patogena, striare l'agente patogeno che trasporta avrRpt2 da uno stock di glicerolo su un mezzo NYG che contiene rifampicina a 100 milligrammi per litro e kanamicina a 50 milligrammi per litro.
Incubare a 28 gradi Celsius per 48 ore. Utilizzando punte di plastica, raccogliere le cellule batteriche che appaiono sulla superficie del mezzo. Trasferire i batteri in un tubo di plastica contenente cloruro di magnesio mulare da 10 milliMolare e rimornerne.
Quindi misurare la densità ottica della soluzione a 600 nanometri. Regolare la concentrazione finale delle cellule batteriche a 100 milioni di unità di formazione di colonie per millilitro che normalmente corrisponde a un OD600 di 0,2. In primo luogo, tagliare con cura una spina cellulare contenente una pianta vecchia di due o tre settimane assicurandosi di non danneggiare la pianta.
Impostare la cella in un vassoio di spina a celle vuote per mantenere un buon equilibrio. Selezionare una foglia visibilmente sana per l'inoculazione. Notando che generalmente, la terza, la quarta e la quinta parte dal fondo della pianta sono facili da maneggiare.
Innaffiare il terreno che trattiere la pianta prima dell'inoculazione per l'imaging time-lapse a lungo termine. Opzionalmente, quando si analizzano i promotori reattivi allo stress, esaminare le foglie sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza prima dell'inoculazione patogena per verificare l'assenza di segnale YFP. Quindi, indossare guanti di lattice monouso per evitare il contatto diretto con l'agente patogeno durante l'infiltrazione.
Utilizzando una siringa di plastica senza ago millilitro, infiltrarsi accuratamente nel lato abaxiale della foglia con la sospensione batterica. L'inoculazione di una piccola porzione su metà della foglia consente una buona visualizzazione dell'attività del promotore PR1. Utilizzare un tovagliolo di carta morbido per assorbire eventuali sospensioni batteriche in eccesso dall'area circostante l'area infiltrata sulla foglia infiltrata.
Immediatamente dopo l'inoculazione, utilizzare il nastro chirurgico per fissare uno scivolo di vetro al vassoio di plastica in modo che la foglia infiltrata si trovi al centro dello scivolo di vetro. Assicurarsi che la lama fogliare inoculata sia completamente montata all'interno dello scivolo di vetro. Tagliare un pezzo di nastro di plastica a doppio strato in due pezzi per adattarsi agli spazi lungo il picciolo della foglia infiltrata e tagliare un angolo da ogni pezzo.
Utilizzando un paio di pinzette fini, attaccare questi pezzi di nastro su entrambi i lati del picciolo in modo che gli angoli tagliati di ogni pezzo si allineino con la base della lama fogliare, assicurandosi che i pezzi di nastro non tocchino il picciolo o la lama fogliare. Preparare quindi un ulteriore pezzo di nastro di plastica a doppio strato, come indicato nella figura due del protocollo di testo. Attaccare questo pezzo di nastro sopra i pezzi precedentemente aderenti per formare un ponte sul picciolo, facendo attenzione a non catturare il picciolo o la lama fogliare direttamente tra i pezzi del nastro.
Quindi attaccare delicatamente un piccolo pezzo di nastro chirurgico sullo scivolo di vetro sopra la punta della lama fogliare in modo che sia fissato molto dolcemente sullo scivolo. Premere saldamente solo sulla parte del nastro che tocca direttamente la diapositiva di vetro. Posizionare delicatamente un altro piccolo pezzo di nastro chirurgico sul bordo del picpeolo e dei pezzi di nastro di plastica in modo che il picpe sia fissato molto dolcemente sia sul vetrino di vetro che sui pezzi di nastro di plastica, assicurandosi di attaccare saldamente solo la parte del nastro chirurgico che tocca direttamente lo scivolo di vetro o i pezzi di nastro di plastica.
Inserire delicatamente nel terreno 200 punte di pipetta in microlitro per tenere delicatamente lontane le foglie vicine dalla foglia infiltrata. Prima accendere lo stereomicroscopio fluorescente. Impostare la pianta nello spazio sotto l'obiettivo dello stereomicroscopio per l'imaging.
Impostare i parametri per l'imaging time-lapse. Utilizzare il filtro YFP convenzionale per visualizzare il segnale YFP. Usate il filtro Texas Red per visualizzare l'autofluorescenza della clorofilla in modo che il dominio PCD sia visibile come un'area scura circondata da strati cellulari positivi all'YFP.
Utilizzare quindi la configurazione convenzionale del campo epi-luminoso per ulteriori fasi di esposizione alla luce, assicurandosi di programmare i passaggi per l'esposizione alla luce durante il periodo di intervallo dell'imaging time-lapse poiché la luce ha un impatto importante sull'immunità dell'impianto. Eseguire il programma di imaging time-lapse. Per l'osservazione a lungo termine per diversi giorni, considera di annaffiare la pianta in modo appropriato.
Dopo l'acquisizione dell'immagine, omettere canali aggiuntivi utilizzati per l'esposizione alla luce negli intervalli dal set di dati. Utilizzando il software di analisi delle immagini, analizza i dati con vari metodi, come l'analisi della regione di interesse. In questo studio, viene dimostrato un metodo versatile per il montaggio di foglie di arabidopsis per l'imaging intravitale time-lapse.
Un esempio rappresentativo di dati di immagine time-lapse utilizzando l'ETI indotto da avrRpt2 è ottenuto sia come serie di immagini che come film time-lapse. In esperimenti riusciti che utilizzano pPR1-YPF-NLS durante l'ETI indotto da avrRpt2, si osserva l'attivazione transitoria del promotore PR1, come evidente dall'YFP che esprime focolai e diversi strati di cellule che circondano il dominio PCD. L'attivazione del promotore PR1 nelle cellule che circondano il dominio PCD di solito inizia a circa cinque ore dopo l'inoculazione, raggiunge picchi a circa 12 ore dopo l'inoculazione e dura fino a 40 ore dopo l'inoculazione.
Quando si tenta questa procedura, le condizioni di time-lapse devono essere stabilite con attenzione come descritto nel testo. Seguendo questa procedura, l'attività del promotore può essere analizzata quantitativamente e qualitativamente, utilizzando software di analisi. Queste analisi ci aiutano ad esplorare la dinamica spatiotemporale dell'espressione genica in qualsiasi evento biologico che si verifichi nelle foglie viventi delle piante di arabidopsis.
