Este método pode ajudar a responder à regulação espostetemporal de um gene de interesse durante evento biológico dinâmico, como imunidade em folhas de arabidopse intactas. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite captar a dinâmica espesso da atividade promotora no solo cultivado em folhas de plantas intactas ao longo de poucos dias. Para iniciar este procedimento, encha uma bandeja de plugue de células plásticas com solo autoclaved.
Semear uma semente de arabidopse transgênica em cada célula. Transfira a bandeja para uma sala de crescimento que é mantida a 23 graus celsius e plante as plantas em condições contínuas de luz branca por duas a três semanas. Dois dias antes da inoculação do patógeno, ester o patógeno que transporta avrRpt2 de um estoque de glicerol para o meio NYG que contém rifampicina a 100 miligramas por litro e kanamicina a 50 miligramas por litro.
Incubar a 28 graus Celsius por 48 horas. Usando pontas plásticas, colhe as células bacterianas que aparecem na superfície do meio. Transfira as bactérias para um tubo plástico contendo 10 milimônios cloreto de magnésio e resuspensá-las.
Em seguida, meça a densidade óptica da solução em 600 nanômetros. Ajuste a concentração final de células bacterianas para 100 milhões de unidades formadoras de colônias por mililitro que normalmente corresponde a um OD600 de 0,2. Primeiro, corte cuidadosamente um plugue de celular contendo uma planta de duas a três semanas de idade, certificando-se de não danificar a planta.
Coloque a célula em uma bandeja de plugue de celular vazia para manter um bom equilíbrio. Selecione uma folha visivelmente saudável para a inoculação. Observando que geralmente, a terceira, quarta e quinta folhas do fundo da planta são fáceis de manusear.
Regar o solo que segura a planta antes da inoculação para imagens de lapso de tempo a longo prazo. Opcionalmente, ao analisar promotores responsivos ao estresse, examinem as folhas sob um estereóscópio de fluorescência antes da inoculação do patógeno para verificar a ausência de sinal YFP. Em seguida, coloque luvas de látex descartáveis para evitar contato direto com o patógeno durante a infiltração.
Usando uma seringa de plástico sem agulha de um mililitro, infiltrar-se cuidadosamente no lado abaxial da folha com a suspensão bacteriana. A inoculação de uma pequena porção em metade da folha permite uma boa visualização da atividade promotora pr1. Use uma toalha de papel macio para absorver qualquer suspensão bacteriana em excesso da área ao redor da área infiltrada na folha infiltrada.
Imediatamente após a inoculação, use fita cirúrgica para fixar um slide de vidro na bandeja de plástico de tal forma que a folha infiltrada esteja localizada no centro do escorregador de vidro. Certifique-se de que a lâmina da folha inoculada está completamente encaixada dentro do slide de vidro. Corte um pedaço de fita plástica de duas camadas em dois pedaços para encaixar os espaços ao longo da petiole da folha infiltrada, e corte um canto de cada peça.
Usando um par de pinças finas, coloque essas peças de fita em ambos os lados da petiole de modo que os cantos cortados de cada peça se alinhem com a base da lâmina da folha, certificando-se de que as peças de fita não toquem na pedola ou na lâmina da folha. Em seguida, prepare uma peça adicional de fita plástica de duas camadas, conforme descrito na figura dois do protocolo de texto. Coloque este pedaço de fita em cima das peças anteriormente aderidas para formar uma ponte sobre a petiole, tomando cuidado para não pegar a petiole ou a lâmina de folha diretamente entre as peças de fita.
Em seguida, coloque suavemente um pequeno pedaço de fita cirúrgica no deslizamento de vidro acima da ponta da lâmina da folha para que ele seja fixado muito suavemente em slide. Pressione firmemente para baixo apenas na parte da fita que está tocando diretamente o slide de vidro. Coloque suavemente outro pequeno pedaço de fita cirúrgica na borda da petiole e peças de fita plástica para que a petiole fique bem fixada tanto no slide de vidro quanto nas peças de fita plástica, certificando-se de apenas fixar firmemente a porção da fita cirúrgica que está tocando diretamente o escorregador de vidro ou as peças de fita plástica.
Insira 200 pontas de pipeta de microliter suavemente no solo para segurar suavemente as folhas vizinhas longe da folha infiltrada. Primeiro ligue o estereóscópio fluorescente. Coloque a planta no espaço sob a lente objetiva do estereóscópio para imagem.
Configure os parâmetros para a imagem de lapso de tempo. Use o filtro YFP convencional para visualizar o sinal YFP. Use o filtro Texas Red para visualizar a autofluorescência de clorofila para que o domínio PCD seja visível como uma área escura cercada por camadas celulares YFP-positive.
Em seguida, use a configuração convencional de campo epi-bright para etapas adicionais de exposição à luz, certificando-se de programar etapas para exposição à luz durante o período de intervalo da imagem de lapso de tempo, pois a luz tem um grande impacto na imunidade da planta. Execute o programa de imagem time-lapse. Para observação a longo prazo ao longo de vários dias, considere regar a planta adequadamente.
Após a aquisição de imagens, omite canais extras utilizados para exposição à luz nos intervalos do conjunto de dados. Utilizando o software de análise de imagens, analise os dados com diversos métodos, como análise de região de interesse. Neste estudo, demonstra-se um método versátil para a montagem de folhas de arabidopsis para imagens intravitais de lapso de tempo.
Um exemplo representativo de dados de imagem com lapso de tempo usando ETI induzido por avrRpt2 é obtido como uma série de imagens e como um filme de lapso de tempo. Em experimentos bem-sucedidos usando pPR1-YPF-NLS durante o ETI induzido avrRpt2, observa-se a ativação transitória do promotor pr1, como evidente a partir de YFP expressando focos e várias camadas de células ao redor do domínio PCD. A ativação do promotor PR1 em células ao redor do domínio PCD geralmente começa em aproximadamente cinco horas após a inoculação, atinge aproximadamente 12 horas após a inoculação e dura até 40 horas após a inoculação.
Ao tentar este procedimento, as condições de lapso de tempo precisam ser estabelecidas cuidadosamente como descrito no texto. Após esse procedimento, a atividade do promotor pode ser analisada quantitativa e qualitativamente, utilizando software de análise. Essas análises nos ajudam a explorar a dinâmica espostetemporal da expressão genética em qualquer evento biológico que ocorra em folhas vivas de plantas arabidopsis.
