Этот протокол может ответить, как различные схемы в головном мозге регулируют нейрогенез для взрослых и, в частности, как стимулирование или ингибирование нейронных цепей влияют на распространение взрослых нервных стволовых клеток. Преимущество этого метода в том, что он способен специально ориентировать желаемые нейронные цепи, а также уменьшить количество стресса, введенного для животных. Этот метод может дать представление о том, как различные схемы мозга регулируют нейрогенез для взрослых, в частности, как конкретные типы клеток, которые высвобождают определенные нейротрансмиттеры регулируют распространение взрослых нервных стволовых клеток.
Чтобы начать эту процедуру, поместите секции тканей в PBS и смонтировать пять-восемь секций на положительно заряженный слайд в серийном порядке от передней до задней. Пусть секции тканей высохнут при комнатной температуре в течение двух-пяти минут и полностью прилипнет к слайдам. Затем подготовь буфер цитрата в контейнере.
Нагрейте буфер цитрата в микроволновой печи в течение пяти минут, пока раствор не закипит. В то же время, поместите установленные секции в стеклянный держатель слайда. Через пять минут аккуратно поместите держатель слайда с секциями в коробку для пипеток.
Установите мощность микроволновой печи до 50%, а время приготовления до семи минут. Запустите таймер в течение семи минут и следите за решением. Остановите микроволновую печь, когда раствор начнет кипеть, и продолжайте микроволновую печь после остановки кипения.
Остановка после таймера иссякнут, даже если время приготовления на микроволновой печи не закончена. Цель этого шага состоит в том, чтобы держать воду прямо ниже температуры кипения, не давая воде чрезмерно кипеть. Слишком много кипения будет удалить ткани разделов со слайда.
Затем перенесите теплую коробку с буфером цитратов и скользит по тканям в ведро со льдом для охлаждения. Обложка поле, и ждать около 30 минут или пока решение прохладно на ощупь, прежде чем приступить к тимидин аналогового окрашивания. Чтобы испачкать секции тканей тимидином, удалите секции тканей из буфера цитратов.
Пусть секции ткани высохнут и полностью прилипают к слайдам, прежде чем нарисовать границу гидрофобной ручкой. Затем пронизыв разделы с буфером пермялизации в течение 20-30 минут. Вымойте секции дважды с помощью TBS-тритон в течение пяти минут каждый раз.
Затем подготовь решение реакции Edu. Инкубировать разделы в растворе реакции Edu в течение 30 минут до часа. Впоследствии мыть их три раза в TBS-тритон в течение пяти минут каждый раз.
Обложка слайды в алюминиевой фольге, или поместите их в светоущитую камеру для защиты от света после этого шага. На этом этапе проверьте, работает ли реакция Эду с помощью флуоресцентного микроскопа. Edu помеченные клетки должны наблюдаться, если реакция работает.
Теперь блокируйте установленные секции тканей, блокируя буфер, поднятый в том же животном, что и вторичное антитело, в течение 30 минут до часа. Затем мыть их дважды в TBS-тритон в течение пяти минут каждый раз. Во время блокирующего шага подготовьйте первичный раствор антитела, смешивая первичное антитело в блокируя буфер.
Впоследствии добавьте 250 микролитров раствора первичного антитела на слайд, чтобы обеспечить полностьюе погружение секций тканей и инкубировать их на ночь при комнатной температуре. На следующий день, мыть секции тканей три раза в TBS-тритон в течение пяти минут каждый, чтобы удалить избыток первичного антитела. Затем инкубировать секции тканей в флюорофор-конъюгированных вторичных антител, подготовленных в блокировании буферного раствора в течение двух часов при комнатной температуре.
Вымойте секции тканей три раза в TBS-тритон в течение пяти минут каждый, чтобы удалить избыток вторичных антител. Затем нанесите 300-микромолейный раствор DAPI на 1 до 100 в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого, мыть ткани разделы три раза в PBS в течение пяти минут каждый, чтобы удалить избыток DAPI, и удалить PAP перо круг вокруг ткани с помощью ватного тампона.
Пусть разделы высохнут, прежде чем применять монтажные средства массовой информации и покрывая их крышками. Используя программное обеспечение для визуализации, откройте изображение каждого раздела извилины в качестве композитного изображения с каналами, объединенными в отдельные цвета, чтобы легко визуализировать колокализацию. Затем измерьте область зубной извилины в каждом разделе с помощью инструмента выбора полигонов и зарегионировать все секции каждой мыши.
Это будет область зубной извилины, используемой для расчета плотности. Используя счетчик клеток плагина программного обеспечения, найденный под Плагинами, Анализ, Счетчик клеток, Счетчик клеток, записывают количество клеток в зубной извилине, которые имеют колокализирующее первичное антитело и тимидин аналог Edu от композитного изображения. Кроме того, завехать общее количество Эду-положительных и nestin-положительных клеток с радиальным процессом.
В случае nestin, очень важно обратить внимание на морфологию клеток. При количественной оценке нервных стволовых клеток, убедитесь, что только клетки с радиальным процессом количественно. Введите количество ячеей в программном обеспечении электронной таблицы для компиляции всех данных для анализа позже.
Например, чтобы получить плотность стволовых клеток, разделите сумму гнездово-положительных и эду-положительных клеток на сумму объема зубной извилины в каждом животном. Рассчитайте объем каждого раздела путем умножения области с общим шагом в один шаг, предполагая, что каждый шаг составляет один микрометр. В этом протоколе, общий шаг должен быть близок к 40, так как ткань разделилась на 40 микрометров.
Впоследствии, рассчитать общее количество размножающихся клеток, процент размножающихся нервных стволовых клеток, и общее распространение клеток после стимулирования контралатеральных мховых клеток. С помощью тимидин аналога Эду и антиген поиска для окрашивания nestin, размножающиеся нервные стволовые клетки были успешно помечены. Кроме того, опустив антиген поиска шаг, Tbr2-положительный нейро-предшественник и neuroblast и DCX-положительных нейробластов и незрелых нейронов были помечены.
Вот пример области количественно и используется для расчета плотности клеток, и вот пример установленной ткани на слайде. Для сравнения показаны как успешные, так и к югу от номинальной программы. Наконец, существует несколько различных количественных данных, которые могут быть получены в результате успешного эксперимента.
Количественные оценки включают плотность размножающихся нервных стволовых клеток, процент размножающихся нервных стволовых клеток, общие размножающиеся клетки и общий пул стволовых клеток. При контралатеральной стимуляции мшистых клеток наблюдалось снижение пролиферации нервных стволовых клеток. Наиболее важным шагом в этой процедуре является контроль ткани кипения в микроволновой печи.
Секции тканей будут повреждены, если они кипятят слишком долго. После следовать этой процедуре, одно смогло впрыснуть по-разному вирусные векторы для того чтобы прицеть такую же цепь. Например, если бы кто-то стимулировал нейронную цепь, можно было бы ингибировать ее с помощью ингибирующего вируса DREADD.
Методы, представленные в этом протоколе, не являются новыми. Тем не менее, сила этого протокола заключается в том, что он охватывает все шаги, необходимые для ответа на вопросы о том, как схема влияет на нейрогенез для взрослых.
