Наш метод рассечения позволяет точно выделить нейрогенную нишу желудочков и поэтому хорошо подходит для изучения молекулярной микросреды этой ниши. Основным преимуществом этого метода рассечения является то, что он точен, эффективен и вызывает минимальное возмущение тканей, но при этом совместим с масс-спектрометрией для анализа протеомов. В этом протоколе мы извлекаем нейрогенную нишу желудочка из мозга мыши, но этот метод также может быть применен к другим видам и в различных состояниях здоровья и болезни.
Техника может потребовать некоторой подготовки. особенно при скальпельных разрезах при обнажении и извлечении желудочковой нейрогенной ниши. После усыпления 8-10-недельной мыши C57 black/6 мужского пола, извлеките мозг путем ручного рассечения и поместите его в культуральную посуду, содержащую ледяную среду для рассечения.
Используя скальпель, удалите обонятельную луковицу, сделав прямой корональный разрез между обонятельной луковицей и внутренним полюсом коры. Затем удалите передний полюс коры, сделав корональный разрез, гарантируя, что боковые желудочки видны в корональной плоскости. Затем с помощью ножниц откройте оба боковых желудочка сверху, начиная с сагиттального сечения от кортикальной поверхности до просвета желудочков.
Удлините этот разрез С-образным способом после сгибания желудочков. Далее соедините каудальные концы левого и правого сагиттального разреза, используя дополнительный корональный разрез. Далее удаляют кору и мозолистое тело, покрывающие медиальные стенки желудочков.
Если ткань прикреплена к медиальным желудочковым стенкам, сделайте дополнительные разрезы или поднимите кору и мозолистое тело ножницами, чтобы выбить ткань. Затем, используя щипцы, удаляют кору и мозолистое тело, покрывающие боковые желудочки. С помощью щипцов аккуратно раздвиньте стенки желудочков и удалите сосудистое сплетение.
Затем положите мозг на стеклянную горку и поместите горку поверх сухого льда, чтобы заморозить мозг стенками желудочков в открытой конфигурации. Перед разделением убедитесь, что мозг прикреплен к пластине прикрепления криостата в заднем мозге с помощью встраивающей среды для замороженных тканей. Кроме того, убедитесь, что никакая среда встраивания не вступает в контакт с передним мозгом, особенно в желудочках.
Затем отрежьте корональные участки мозга толщиной от 50 до 100 микрометров до конца бокового желудочка и установите участки на стеклянные слайды. Поместите стеклянные слайды на сухой лед под рассеченный микроскоп. Поднимите ломтики из сухого льда на 15-30 секунд, чтобы добиться кратковременного, неполного оттаивания, сделав компактный миелин полосатого тела наблюдаемым в виде плотных белых точек.
Затем, используя предварительно охлажденный скальпель, отделяют субэпендимальную зону от соседнего полосатого тела и переносят его целым куском или разрезанным на две-четыре части в микроцентрифужную трубку с помощью тупого края охлажденного скальпеля. Затем проделайте то же самое для медиальной желудочковой зоны. Миелин-ассоциированные, гликопротеин-положительные внутренние капсулы полосатого тела были идентифицированы во всех образцах, но редко в крио-секционно-диссекционных образцах с помощью иммуногистохимии.
Стриатальное загрязнение в образцах wholemount было подтверждено обогащением миелиновых белков в субэпендимальной зоне по сравнению с образцами сомато-сенсорной коры. Напротив, сравнение этих белков-маркеров миелина в образцах крио-секции-диссекции не показало существенных различий в субэпендимальной зоне и образцах сомато-сенсорной коры. При сравнении результатов масс-спектрометрии между криосекцией-рассечением и микродиссекцией лазерного захвата микродиссекция лазерного захвата дала примерно вдвое меньше количественных белков, хотя время сбора тканей было примерно в два раза больше.
Принципиальный компонентный анализ показывает, что существует большая вариабельность среди образцов, собранных с помощью микродиссекции лазерного захвата, изображенных в виде квадратов, чем среди образцов, собранных с помощью криосекции-рассечения, изображенных в виде кругов. Тест на обогащение 2D-аннотации между криосекцией-рассечением и микродиссекцией лазерного захвата для субэпендимальных и медиальных эпендимальных зон выявил аналогичное обогащение как в методах, так и в областях для белков, связанных с внеклеточным пространством. Криосекция-диссекция обеспечивает более надежную идентификацию и количественную оценку нейрогенеза в субэпендимальных зонально-ассоциированных белках внеклеточного матрикса.
В случае тенасцина-С только криосекция-диссекция отображала обогащение в субэпендимальной зоне по сравнению с медиальной эпендимальной зоной. Следите за тем, чтобы участки мозга на слайдах не стали полностью размороженными. В целом, хорошо практиковать этапы процедуры рассечения для получения последовательного результата.
Метод рассечения также может быть использован с другими методами анализа белка, которые могут легко обнаружить очень низкие обильные белки, такие как факторы роста и цитокины. Этот метод микродиссекции позволил нам идентифицировать новый регулятор нейрогенеза, и мы считаем, что он позволит другим идентифицировать другие регуляторы нейрогенеза в различных контекстах.
