Этот протокол представил простой и надежный метод измерения алкализованной активности фосфатазы в биопленоченой культуре S.aureus. Это поможет нам понять функцию ALP в формировании биопленки. Основным преимуществом этой техники является высокая пропускная способность.
Это очень чувствительный и простой в работе. Демонстрацией процедуры будет Кевин Даниковски, бывший студент колледжа Харпер. Для приготовления TSB добавьте в дистиллированную воду поджелудочной железы кейсин, папаический дайджест соевого шрота, хлорида натрия, декстрозы и фосфата дипотазия.
Обложка колбу с алюминиевой фольгой и положить его в автоклав для стерилизации перед использованием. Чтобы подготовить TSA, добавьте агар в TSB и положите его в автоклав для стерилизации. Затем дайте ему остыть до комнатной температуры.
Затем вылейте его в чашку Петри в соотношении 20 миллилитров на тарелку. Чтобы подготовить биопленку культуры среды, добавить глюкозы в autoclaved TSB для достижения концентрации 10 граммов на литр. Используя комплект вакуумной фильтрации, фильтруйте раствор фильтром размером с 0,2 микрометра.
Чтобы привить, используйте стерилизованную петлю прививки, чтобы выбрать одну индивидуальную колонию золотистого стафилококка из чашки Петри и поместить его в культурную трубку, наполненную 10 миллилитров TSB. Положите трубку в инкубатор, чтобы расти на ночь при 37 градусах по Цельсию. С помощью микропипетта нарисуйте 100 микролитров ночной культуры и перенесите его в культурную трубку, наполненную 10 миллилитров TSB с глюкозой для разбавления соотношения объема 1:100.
Vortex осторожно смешивать для последовательной концентрации. Используйте микропипюту для передачи 200 микролитров разбавленной культуры в общей сложности 18 скважин из одной пластины 96 скважин. Инкубировать пластину 96 хорошо при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов для формирования биопленки.
Для лучшего формирования биопленки S.aureus, лучше выбрать плоский или круглый нижний 96 хорошо пластины. После этого слегка наклоните пластину, чтобы декантанта стремлением от края каждой хорошо. Вымойте каждый хорошо с 1X PBS.
Положите пластину в центрифугу, чтобы вращаться в течение пяти минут при 8000 оборотов в минуту и декантировать супернатант стремлением. Добавьте 75 микролитров буферного субстрата ALP, состоящего из коммерчески доступных PNPP к каждой колодец и используйте таймер для записи каждой точки времени в тройном. После каждой точки инкубации добавьте 75 микролитров пяти гидроксида молярного натрия в каждую из трех скважин, чтобы остановить реакцию.
Центрифуга пластины в течение пяти минут при 800 оборотов в минуту. Используйте пипетку для передачи 100 микролитров супернатанта в новую пластину 96 хорошо для калорийного измерения. Используйте 96 хорошо пластины читателя для измерения абсорбтности каждой хорошо на 405 нанометров.
Используйте 30-минутные точечные скважины для управления фоновым шумом. Повторите весь эксперимент в трех пластинах 96 хорошо. Этот протокол разрабатывает быстрый и надежный анализ для измерения активности ALP в биопленке S.aureus, которая не требует белковой изоляции.
Репрезентативный результат активности ALP показывает повышенную тенденцию на срок до 75 минут. Через 75 минут никакого увеличения активности ALP не наблюдалось. Очень важно создать хорошую культуру биопленки, и это может занять довольно много испытаний, чтобы освоить.
Вы можете подтвердить образование биопленки, выполняя кристально фиолетовый анализ, как сообщалось ранее нами и другими, или вы можете предварительно лечить пластину с человеческой плазмы для облегчения формирования биопленки. После его разработки, вы можете экран потенциальных ингибиторов ALP, которые могут помешать формированию биопленки. Результат даст важную информацию для управления биопленкой в медицинской сфере.
Пять гидроксида натрия моляра могут быть опасны в случае контакта. Обязательно носите средства индивидуальной защиты при обращении.
