Этот протокол облегчает использование человека плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов для применения скрининга высокого содержания. Он особенно хорошо подходит для анализа синапсов, которые в нейронах человека требуют длительных периодов культуры. Мы демонстрируем перебрасывания нейронов из большого формата блюд в HCS-совместимых нескольких скважин таким образом, чтобы сохранить их жизнеспособность.
Контринтуитивно, мы показываем, что расширение инкубации протеазы до повторного перерасхода и replating дает улучшение выживания нейронов. Нейроны, полученные из стволовых клеток человека, становятся все более актуальными в области фундаментальных исследований, разработки лекарственных средств и дегенеративной медицины. Этот метод мягкого титроваения может быть использован для повторного использования любого большого монослоя клеток, имеющих толстую сеть процессов.
В дополнение к человеческим iPSCs, он может быть использован для повторения культуры первичных нейронов или повторного использования их для сортировки фактов или секвенирования одной клетки. Важно внимательно следить за шагами протоколов и часто следить за протеазой опосредованного отслоения нейронов от пластины. Оптимальное время инкубации может варьироваться в зависимости от культуры.
Визуальная демонстрация позволяет даже неопытным следователям воспроизвести эту процедуру. Начните с мягко полоскания пластины дифференцированных нейронов с PBS. Разогнать PBS вниз по стене пластины, а не непосредственно на клетки, чтобы избежать их нарушения.
Аспирировать PBS от края блюда, опрокидывая его, заботясь, чтобы не коснуться клеток. Нанесите по крайней мере один миллилитр протеолитического фермента на 10-сантиметровую пластину. И вернуть клетки в инкубатор на 40-45 минут.
Во время инкубации проверьте нейроны на фазовом контрастном микроскопе и продолжайте лечение протеазой до тех пор, пока нейронная сеть полностью не отсоединится от пластины и не начнет распадаться. Когда нейроны отсоединились, остановить пищеварение, добавив пять миллилитров свежих DEMEM средств массовой информации на каждый миллилитр протеазы. Используйте серологический пипетки, чтобы аккуратно титровать клетки против пластины пять-восемь раз, убедившись, что не применять слишком много давления.
Процедить клетки через 100 микрометровую сетку в 50 миллилитров конической трубки, капля за каплей. И промыть ситечко с дополнительными пятью миллилитров свежих СРЕДСТВ массовой информации DMEM. Используйте центрифугу на скамейке, чтобы вращать клетки вниз на 1000 раз G в течение пяти минут.
После центрифугации, вернуть коническую трубку в шкаф биобезопасности и аспирировать большинство средств массовой информации, в результате чего 250 микролитров держать клетки влажными. Аккуратно перерасходовать клетки в двух миллилитров свежих СРЕДСТВ массовой информации DMEM затем передать их через конец пяти миллилитров серологического пипетки. Наконец, инвертировать трубку два-три раза.
Используйте гемоцитометр и трипан синий, чтобы подсчитать жизнеспособные клетки. А потом DMEM до нужной концентрации. Добавьте соответствующие добавки в трубку, в зависимости от требований конкретной клеточной линии и аккуратно смешайте клетки, наклонив коническую трубку два-три раза.
Аспират ламинина покрытие из 24-хорошо пластины и промыть его один раз с PBS. Аспирировать PBS. И применить клеточное решение к каждой хорошо в рисунке восемь движения, чтобы избежать слипания.
Когда закончите покрытие клеток, вернуть пластину в инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Кратко вихрь фондового решения ранней клеточной смерти репортера и добавить его в скважины в соответствии с рукописными направлениями. Подождите 20 минут.
А затем изображение живых и мертвых клеток на стеклянном дне нескольких колодцев. Продление инкубации протеазы позволяет ослабить нейронную сеть в пределах поднятого листа клеток. Это приводит к снижению смертности клеток во время диссоциации, а также приводит к более эффективному восстановлению в течение следующих дней.
Используя расширенную процедуру инкубации ферментов, культуры демонстрируют приблизительное удвоение жизнеспособности клеток в течение нескольких дней после повторного покрытия и более низкую плотность мертвых или умирающих клеток. Переходная фаза нейрональной дифференциации происходит в течение нескольких дней, в течение которых клетки постепенно выражают поздние нейронные маркеры. Эти маркеры сразу же обнаруживаются в культурах, которые были replated после четырех недель предварительной дифференциации.
Расширенный протокол протеазы также умеренно повышает рост нейрида. Улучшается как общая длина нейрида, так и рост дендрита. Replating также полезен для изучения синапсов.
Всего через неделю после повторного покрытия наблюдались маркеры до- и пост-синаптических белков. Кроме того, электрическая активность от спонтанной деполяризации и синаптически управляемых тока обнаруживается с помощью кальциевых изображений или многоэлектродных массивов. Эта процедура повторного покрытия может быть адаптирована к многим типам приложений.
В дополнение к высокому содержанию скрининга для выявления потенциальных терапевтических соединений, он может быть использован для изображений конусов роста или многоэлектронные записи массива. Механическая диссоциация нейронов, которые уже сформировали длительные процессы, является стрессом. Удлиненная энзиматическая инкубация и нежное титрование клеток являются важными шагами для успеха этой процедуры.
