Этот протокол представляет метод переходного улучшения сердечной функции у мышечную дистрофию мышей Дюшенна путем пересадки экзона, полученного из нормальных миогенных клеток-предшественников. Экзосомная трансплантация может улучшить функцию сердца у мышей DMD в связи с увеличением экспрессии дистрофии в сердцах реципиентов. Соответствующий метод экзонной изоляции, очищения и трансплантации внутримыкардного интрамиокарда способствует успеху экзон-трансплантации для улучшения сердечной функции мышей с мышечной дистрофией Дюшенна.
MPC полученных экзосомы терапии может улучшить функцию скелетных мышц путем экзосомы опосредовано нормальной дистрофина мРНК передачи. Это видео демонстрирует критические методы экзосомы очистки, внутримиокарда экзосомы доставки, и эхокардиографии после трансплантации. Демонстрацию эхокардиографии будет делать Ян Шен, техник из нашей лаборатории.
Чтобы начать эту процедуру, семя пять миллионов клеток C2C12 в 15 сантиметров культуры блюдо с 20 миллилитров полного DMEM, содержащий 10%FBS и антибиотики. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Затем используйте качающийся ротор ведра для ультрацентрифуга FBS при 100 000 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 18 часов для подготовки экзосомной истощенной среды.
Отбросьте гранулы и соберите супернатант. Когда клетки монослоя достигают 80% слияния в культуре блюдо, заменить полный DMEM с экзосомы истощенной среде. Используйте перенесите пипетку, чтобы собирать супернатант из блюда клеточной культуры каждые 48 часов.
Центрифуга труб при 150 раз G в течение десяти минут, чтобы удалить оставшиеся клетки. Фильтр супернатант через 0,22 микрометровый фильтр для устранения любого клеточного мусора и передачи фильтруемой среды в ультра-чистые трубки. Далее, используйте качели ведро ротора для ультрацентрифуга труб на 100, 00 раз G и при 4 градусах по Цельсию в течение 120 минут, чтобы вызвать экзосомы.
Повторное распределение экзосомсодержащих гранул в PBS, а затем заполнить всю ультра-чистую трубку с PBS. Ultracentrifuge этой подвески на 100, 00 раз G и при 4 градусах по Цельсию в течение 120 минут для устранения загрязняющих белков. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы экзосомы в 100 микролитров PBS.
Хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию для использования в будущем. Во-первых, исправить каждый анестезировал мышь в положении на спине на хирургической платформе, обеспечивая каждую конечность с лентой. Поместите 3-0 шва горизонтально ниже верхних зубов, чтобы держать верхнюю челюсть на месте.
Затем нанесите крем-депиляатор на левую сторону груди мыши, чтобы удалить пихту с кожи. Используя 24 калибровочный катетер, выполните эндотрахеальную инотубицию через полость рта. И используйте вентилятор грызунов, чтобы проветрить мышь комнатным воздухом со скоростью 195 вдохов в минуту.
Дезинфицировать кожу 70% алкоголем и 10%повиденым йодом. Затем сделайте косой разрез длиной от 10 до 15 миллиметров от левого кормового края до левой подмышки. Используйте ножницы, чтобы сократить pectoralis мажор и пекторалис несовершеннолетнего.
И сделайте левый торакотами через четвертое межреберный космос. Аккуратно вставьте полосы ретрактора, чтобы распространить грудную полость на ширину 10 миллиметров, заботясь о том, чтобы не повредить левое легкое. После этого используйте два прямых пинцета для удаления перикардия.
Потяните их друг от друга и поместите их за втягивателя советы подвергать сердце. Используйте 31 калибровочной инсулиновой иглы для введения либо MPC-Exo или PBS внутримойокардиально в передней стенке левого желудочка на одном сайте. Затем используйте 6-0 нейлоновых швов, чтобы закрыть грудную полость, мышцы пекторали и кожу, в последовательности.
Через два дня после трансплантации экзосомы PBS, анестезировать мышей, как указано в текстовом протоколе. Используйте ленту, чтобы зафиксировать мышь в положении на спине и нанесите разогретый акустический гель на левую область груди. Затем используйте эхокардиографию для оценки функции левого желудочка.
Получить парастернал длинный вид оси левого желудочка в двух измерениях, а затем повернуть ультразвуковой зонд 90 градусов, чтобы получить левый желудочек короткий вид оси на уровне папиллярной мышцы. После этого записывают эхокардиографические изображения M-режима и измеряют левый желудочковый энд-диастолический диаметр, левый желудочковый энд-систолический объем, левый желудочковый энд-диастолический объем и левый желудочковый энд-систолический объем. Сердечный ритм мышей следует контролировать по крайней мере 400 bpm для сердечной функции измерения.
После того, как экзосомы изолированы и очищены от клеток C2C12, их присутствие подтверждается с помощью анализа электронной микроскопии передачи. На изображении электронной микроскопии передачи показана морфология ярких и круглых пузырьков экзосомы C2C12. Западный анализ помарки подтверждает наличие экзосомных маркеров, включая CD63 и Tsg101.
Полупрозрачная область отеков наблюдается после инъекции внутримякардного периода в переднюю стенку левого желудочка мышей mdx, что указывает на успешное введение в миокард. Иммунофторесцентное окрашивание дистрофина затем выполняется, чтобы определить, является ли сердечная доставка MPC-Exo восстанавливает выражение дистрофина-белка в сердцах mdx. Частичное восстановление экспрессии дистрофина наблюдается при локализации мембран в некоторых кардиомиоцитах.
Сердечная функция измеряется эхокардиографией через два дня после интрамиокарда доставки, чтобы определить, является ли транспляция MPC-Exo улучшает сердечную функцию у мышей mdx. MPC-Exo лечение рассматривается для улучшения внутренней стенки движения по сравнению с PBS, предполагая, что MPC-Exo трансплантации улучшение сердечной функции у mdx мышей. Использование 31 калибра инсулина иглы с кончиком около 20 градусов имеет решающее значение для успеха для доставки большинства экзосом в миокард и максимизирует воздействие инъекционных экзосом для размещения кардиомиоцитов.
После процедуры, выражение дистрофина может быть обнаружено после MPC полученных экзосомы инъекции иммунофторесцентного окрашивания, указывающие на то, что сердечный MPC полученных экзосомы доставки восстанавливает дистрофин-белковое выражение. Этот метод проложит путь для лечения кардиомиопатии с экзосомо-несущих терапевтических генетических материалов, включая ДНК, мРНК, lncRNA, или микроРНК.
