Этот протокол имеет важное значение, поскольку он может быть использован для создания человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов, которые могут быть использованы для моделирования мышечных заболеваний и для проведения доклинального терапевтического тестирования. Эта модель ксенотрансплантата позволяет исследователям изучать человеческие мышцы in vivo, чтобы лучше понять биологию мышечных клеток человека и разработать новые модели редких или приобретенных мышечных заболеваний. После получения биопсии мышц человека поместите образец в чашку Петри размером 100 на 15 миллиметров, содержащую мышечную среду, и используйте стерео микроскоп и хирургические ножницы для удаления оставшейся фасции или жировой ткани.
Рассеките биопсию мышц примерно на три на три миллиметра, заботясь о том, чтобы волокна были расположены продольно внутри образца. Затем перенесите чашку Петри, содержащую расчлененную мышцу на лед, и поместите синтетические, неаспасимываемые швы в чашку Петри размером 100 на 15 миллиметров из 70% этанола. После подтверждения отсутствия ответа на щипать в 8-12-недельный, анестезированный NOD-Rag-гамма мыши, применять мазь на глазах иммунодефицитного животного, и использовать триммер, чтобы удалить волосы чрезмерно tibialis передней от лодыжки до колена.
Затем нанесите депиляативный крем на обитаемую кожу в течение одной минуты, прежде чем дезинфицировать хирургическое отделение раствором пувидона-йода и 70%этанолом. Чтобы привить человеческую ткань, сначала лентой вниз мыши ногу, и сделать прямой разрез над голени, происходящих на дистальных сухожилий и прекращения ниже колена. Используйте тупое вскрытие, чтобы отделить кожу от мышечной ткани, и использовать ножницы, чтобы сделать менее чем 0,5-миллиметровый разрез через эпимизий передней мышцы голени, начиная с сухожилия и заканчивая коленом.
После резки дистального сухожилия голени передней, схватить сухожилие с радужной оболочки миок, и тянуть мышцы вверх к колену. Далее, сократить дистальное сухожилие дитенсора digitorum longus, и вытащить дитенсор digitorum longus к колену. Как только проксимальное сухожилие мышцы peroneus longus видно, удалите дитенсор digitorum longus и tibialis передней с ножницами.
Используйте хирургическую салфетку мокрой с PBS, чтобы применить небольшое давление, пока гемостаз не будет достигнут, и нить шва через проксимальный перон longus сухожилия, в результате чего примерно 1,5-дюймовый кусок нити по обе стороны сухожилия. Сделайте первую половину двух рук хирургического квадратного узла без затягивания, чтобы сформировать круг, и поместите ксенотрансплантат в круг, затягивая петлю, чтобы обезопасить трансплантатную ткань. Завершите другую половину квадратного узла, чтобы шов ксенотрансплантата проксимального сухожилия перонеус longus, и нить шва через дистальный peroneus longus сухожилия повторить технику квадратного узла на дистального сухожилия.
Когда оба конца трансплантата были обеспечены, потяните кожу над ксенотрансплантированных мышц, печать разрез с хирургическим клеем, и место два-три хирургических скобы над клеем. Затем поместите мышь в чистую клетку на нагретую площадку с мониторингом до полного лежачих времени. Через четыре-шесть месяцев после операции поместите крытый стакан, содержащий 200 миллилитров 2-метилбутана, в коробку сухого льда в течение по крайней мере 30 минут до сбора ксенотрансплантата.
Когда 2-метилбутан остынет, подтвердить отсутствие реакции на щепотку носа, и удалить волосы чрезмерно голени передней от лодыжки до колена с триммером и депилятивным кремом. Швы, держащие ксенотрансплантат на месте, следует наблюдать через кожу. Закрепте ногу лентой и используйте ножницы и щипцы радужной оболочки глаза, чтобы открыть кожу над ксенотрансплантом до тех пор, пока оба шва не будут обнаружены.
Используйте скальпель, чтобы сократить между ксенотрансплантатом и голени, чтобы освободить одну сторону ксенотрансплантата перед резки между мышцей перонеуса longus и мышцы гастроконемиуса. Вырезать ниже дистального шва и через дистальное сухожилие peroneus longus, и использовать радужную оболочку миппы, чтобы схватить и отвлечь шв к колену при использовании ножниц, чтобы сократить ксенотрансплантат от основной мышечной ткани. Затем используйте ножницы, чтобы вырезать выше проксимального шва, чтобы удалить ксенотрансплантат и перонеус longus, и поместить собранный образец на небольшой кусок картона.
Прикрепите ткань как можно ближе к швам, мягко растягивая мышцы, чтобы убедиться, что ориентация волокна будет поддерживаться во время процесса snap-freezing. Когда булавки надежно на месте, слайд мышцы вверх булавки так ткани лежит чуть выше картона, и оснастки заморозить ксенотрансплантат в предварительно охлажденных 2-метилбутан для минус 80 градусов по Цельсию хранения. Успешный ксенотрансплантат демонстрирует надежную регенерацию миофиберов человека, отождествляемых с специфическими для человека антителами.
Положительные эмбриональные окрашивания миозин в пропорции миофиберов указывает на то, что процесс регенерации все еще продолжается. В отличие от этого, плохая хирургическая техника или неадекватный образец может привести к плохой регенерации мышечных волокон. Ксенотрансплантаты, выполняемые у пациента с диагнозом идиопатическая воспалительная миопатия, демонстрируют умеренное количество регенерированных миофиберов человека в четырех- и шестимесячных коллекциях, а эмбриональное окрашивание миозином сохраняется в течение шести месяцев.
Воспалительные клетки также присутствуют в ксенотрансплантате, как это наблюдается H и E окрашивания. Индивидуальные размеры миофибера похожи между четырьмя и шестью месяцами при идиопатических воспалительных ксенотрансплантатах. Редкие волокна, показывающие поперечную площадь более 3, 500 микрометров в квадрате наблюдаются в ксенотрансплантатах, но не в идиопатической воспалительной биопсии миопатии, что указывает на то, что некоторые из миофиберов в ксенотрансплантатах могут регенерировать к поперечной области, похожей по размеру на здоровые миофиберы.
Наиболее важными частями этой процедуры являются выявление всех сухожилий в лодыжке после первоначального разреза и успешно резки через эпимизий. Функциональную компетентность ксенотрансплантатов можно оценить, опоясывая одиночные миофиберы и проверяя преходящие кальция или выполняя вызванные принудительные измерения после электрической стимуляции.
