Эта модель рака эндометрия VX2 с ретроперитонеальным метастазом лимфатических узлов может быть использована для изучения технологии для хирургии, управляемой изображениями. Основные преимущества этой техники в том, что она надежна, проста, и что она создает последовательное метастатическое распространение, которое имитирует картину рака эндометрия человека. В целом, это простой метод.
Тем не менее, практика шва до попытки создать модель поможет сделать процесс проще. Визуальная демонстрация этой техники важна, так как она помогает продемонстрировать хирургические шаги, связанные с созданием модели. Демонстрация процедуры с Харли Чан и я буду Лили Дин, техник из нашей лаборатории.
Для подготовки клеток VX2, распространяемых в пробирке, начните с нагрева замороженных флаконов клеток VX2 в бисере или водяной бане на 37 градусов по Цельсию в течение одной минуты. Когда клетки разморозились, потяните клеточные суспензии в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров среды культуры. Осадок клеток центрифугации.
Переусейте гранулы в девяти миллилитров среднего. Передача клеток в большую культурную колбу для инкубации при 37 градусах Цельсия без встряхивания, ежедневно проверяя клетки на слияние с помощью световой микроскопии. Когда клетки достигли 80%-ного слияния, добавьте три миллилитра 0,2%трипсина в колбу и верните клетки в инкубатор культуры клеток в течение пяти минут.
Когда клетки отсоединились, перенесите подвесную клетку в коническую трубку, чтобы собрать клетки путем центрифугации. Вымойте гранулы клетки три раза с девятью миллилитров свежего PBS за стирку. После последней стирки, повторное распределение клеток в свежем PBS для подсчета до разбавления в четыре раза 10 до семи клеток VX2 на миллилитр концентрации PBS в новой конической трубки на льду.
Для подготовки в vivo-распространяемых клеток VX2 для инъекций, оттепель замороженных один на один сантиметр VX2 опухолевых блоков и использовать скальпель, чтобы фарш образцов тканей в культуре пластины. Перенесите фрагменты тканей в 70-микрометровый фильтр и добавьте небольшие алициты до одного миллилитра сбалансированного соленого раствора Хэнка, или HBSS, чтобы убедиться, что все клетки проходят через ситечко. Затем подсчитайте клетки перед разбавлением клеточной суспензии в один раз от 10 до семи клеток VX2 на миллилитр концентрации HBSS в стерильной трубке на льду.
После подтверждения отсутствия реакции на стимул, поместите анестезированной самки белого новозеландского кролика в спинное положение на операционном столе. Клип волосы над тазом и животом, и использовать три шага хирургической подготовки кожи для очистки открытой кожи. Ношение хирургической шапки и маски для лица, скраб руки с дезинфицирующим средством, прежде чем надеть стерильное платье и стерильные хирургические перчатки.
Ориентир верхней части лобковой кости и драпировка хирургического поля с лапаротомии шторы, в результате чего пять на пять сантиметров области нижней части живота подвергаются. Далее, используйте номер 11 скальпель лезвие, чтобы сделать 2,5-сантиметровый разрез один сантиметр черепа симфиза лобка через кожу и подкожной ткани. Incise прямой фасции и вскрыть мышцы прямой кишки боковой подвергать основной брюшной полыши.
Подтвердите, что подповерхностная поверхность очищена от кишечника или других органов брюшной полости. Резко введите брюшной полых, чтобы определить мочевой пузырь и развертки в перчатках палец выше, задним, а затем над вершиной мочевого пузыря, чтобы найти рога матки. Извлеките рога матки через разрез брюшной полости, чтобы отдохнуть на брюшной стенке.
Используйте 3-0 плетеные абсорбируемые швы для выполнения одной перевязки шва каждого рога матки, примерно от 1,5 до двух сантиметров дистальной шейки матки и просто медиальной для маточных артерий. Затем связать швы плотно включить дистальные рога матки. Чтобы привить миометрий с ранее подготовленной клеточной подвеской VX2, загрузите одноми миллилитровый шприц, оснащенный иглой 27-го калибра с одним миллилитром клеток.
Медленно ввилите 0,5 миллилитров клеточной суспензии в течение одной минуты в каждый маточные рога проксимальные к месту шва между швом и шейкой матки. Затем нанесите давление на место инъекций миометрия в течение 30 секунд, чтобы свести к минимуму утечку клеток. Осмотрите места инъекций и швов на гемостаз перед тем, как поместить рога матки обратно в брюшную полость.
Для глубокого закрытия брюшной стенки, определить вершину перитонеального разреза и использовать хирургический зажим, чтобы понять мышцы прямой кишки и фасции. Якорь шва, поставив 3-0 абсорбируемых полифиламент шов, поверхностный глубоко на одной вершине разреза, и глубоко поверхностно, с другой стороны. Используя прикрепленный шов, сделать работает стежки перпендикулярно разрез через слои брюшной стенки, работая шаг за шагом вдоль разреза из стороны в сторону, прежде чем связывать шв и резки свободные концы.
Для поверхностного закрытия брюшной стенки, используйте похоронен работает подкожный 3-0 абсорбируемых полифиламент шов для шва глубоко поверхностно с одной стороны разреза и поверхностные глубоко с другой стороны. После завязывания швов, используйте якорные швы, чтобы сделать работает стежки в дермальный слой параллельно разрезу, работая шаг за шагом вдоль разреза из стороны в сторону. Свяжите швы и удалите свободные концы.
Нанесите хирургический клей на закрытый разрез, чтобы зарезать края кожи. Затем поместите животное на теплое одеяло с кислородом и мониторинг, пока животное не будет начеку и не сможет сидеть самостоятельно. При создании этой модели, доза от двух раз 10 до семи клеток на рога матки был успешным в четырех кроликов, в среднем время 45 дней от прививки до эксперимента и, таким образом, определяется как оптимальная доза инъекции для культурных VX2 модели.
Для виво-распространяемой модели VX2, которая была успешно создана в 16 кроликов со средним временем от прививки до эксперимента 29 дней, пять раз от 10 до шести клеток на рог матки была определена в качестве оптимальной дозы инъекции. Все модели привели к успешной метастатической трансформации ретроперитонеаных лимфатических узлов. Кроме того, опухоли и метастатические лимфатические узлы из культурных клеток VX2 оказались похожими на опухоли из виво-распространяемых клеток VX2 по гистологическому анализу, с денсиметоксолин-окрашенных клеток наблюдается в вторгающейся мышцы и формирования железистых, как структуры со многими патологическими митотических фигур.
Поместите шов медиальной артерии матки, чтобы избежать кровотечения из прокола сосуда и заботиться, чтобы проникнуть в клетки в миометрии, а не эндометрия полости. Позаботьтесь, чтобы использовать правильную стерильную технику во время создания модели, чтобы предотвратить послеоперационную инфекцию и защитить себя с барием материала во время операции.
