Меланома широко диагностируется во всем мире, с ростом заболеваемости. Эти протоколы позволяют тщательно контролировать ранние стадии инициации меланомы, облегчая изучение ее развития. Контролируя время и расположение активации стволовых клеток меланоцитов, мы можем различить изменения в популяции стволовых клеток и ее новое начало меланомы штамма.
Демонстрацией процедуры будут Дахим Ким и Луйе Ан, аспиранты лаборатории. За два-три дня до начала процедуры используйте электрический триммер для бритья спинной кожи от каждой обезболивающей семинедельной мыши. В день эксперимента используйте ватный тампон, чтобы нанесите тонкий слой крема для депилямента на обыщевную кожу.
После того, как крем был равномерно применен, используйте чистые ватные тампоны, чтобы удалить крем, а затем нежный вытирая влажной тканью, чтобы удалить любые остаточные сливки. Затем вернуть каждую мышь в свою домашнюю клетку с мониторингом до полного выздоровления. Для облучения УФ-В накройте спинную кожу ультрафиолетовым защитным материалом, чтобы подвергаться воздействию только нужной области, и накройте УФ-камеру УФ-резистентной крышкой.
Затем включите лампу UV-B, чтобы облучить мышь в течение соответствующего экспериментального периода времени, прежде чем вернуть мышь в пустую клетку с мониторингом до полного выздоровления. Чтобы изолировать образцы кожи, используйте электрический триммер, чтобы удалить любые волосы из спинной области кожи облученных мышей, и слегка щеткой подвергаются кожи с ворсинки свободной ткани, чтобы очистить область. Сделайте небольшой разрез острыми ножницами чуть выше основания хвоста и вставьте большие тупые ножницы в разрез, чтобы отделить поддермальные соединительные ткани.
Используя острые ножницы, тщательно вырезать вдоль края кожи области интереса, чтобы изолировать образец ткани и поместить вырезанной ткани кожи на чистое бумажное полотенце. Затем используйте тупые типсы, чтобы растянуть кожу так, чтобы она придерживалась полотенца и была подтянутой. Когда все образцы были собраны, поместите образец кожи и бумажное полотенце поддержку в кусок сложенной фильтровальной бумаги непосредственно рядом с складкой, заботясь о том, чтобы образец гладкий и не сложенный или мятый.
Закройте стороны фильтровальной бумаги скобами и обрежьте бумагу. Затем полностью погрузить образцы в 10%нейтральный буферный формалин в течение трех-пяти часов при комнатной температуре перед мытьем тканей с двумя пятиминутными мойки в деионизированной воде. После второй стирки тщательно удалите остаточный материал из тканей кожи и обрежьте края образцов так, чтобы они не были зубчатыми.
Затем сделайте три прогиба в каждом образце так, чтобы ширина полос не более пяти миллиметров, и сделайте поперечные разрезы так, чтобы образцы были не более 20 миллиметров в ширину. Позиция крио плесень, содержащая оптимальную температуру резки или OCT среды в портретной ориентации, и место от четырех до пяти кусков кожи на вершине OCT. Когда все части находятся на месте, использовать две пары тонких типсов довести длинный край каждого куска кожи в нижней части крио формы так, что образцы вертикальны в рамках OCT и перпендикулярно основанию формы.
Затем заполните форму с дополнительными OCT на вторую губу и поместите плесень на плоскую поверхность куска сухого льда, используя типсы, чтобы настроить любые части кожи, которые, возможно, сместились во время передачи, как блок начинает замерзать по мере необходимости. Когда мышам семь недель послеродового, их спинная кожа находится в телогене. Во время телогена, волосяной фолликул и меланоцитов стволовых клеток, как известно, в состоянии покоя, и кожа не должна показывать значительный рост волос после бритья.
Химическая депиляция, однако, может вызвать активацию стволовых клеток волосяного фолликула, вызывая значительный рост волос в пределах области интереса. Поскольку химическая депиляция может значительно вызвать активацию как волосяного фолликула, так и меланоцитов стволовых клеток, склонных к меланоме меланоцитов стволовых клеток в активном состоянии может образовывать опухоли и микроскопической меланомы начала можно наблюдать в течение двух недель после химического депиляции. УФ-B облучение может также вызвать инициирование опухоли из тихие, опухолевые меланоциты стволовых клеток.
Важно отметить, что УФ-В индуцирует прямую транслокацию стволовых клеток меланоцитов из их фолликулярной ниши стволовых клеток в меж фолликулярный эпидермис. Кроме того, УФ-B может вызвать образование меланоцитов стволовых клеток, происходящих из кижной меланомы на протяжении всего межфолликулярного эпидермиса. Как и спинной кожи, УФ-B-индуцированной меланомы инициации можно заметно наблюдать в других областях кожи, таких как кожа уха.
Действительно, по сравнению с контрольной кожей уха, покрытой УФ-резистентной тканью, кожа уха, подвергаемая воздействию УФ-В, демонстрирует более высокую пигментацию из-за более высокого бремени начала меланомы. Различные дозы УФ-В могут иметь различное влияние на кожу мыши и меланоцитов деятельности. Поэтому важно определить и оптимизировать дозу облучения до начала эксперимента.
