Текущий протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет исследователям производить наночастицы, загруженные siRNA, и адекватно охарактеризовать эти наночастицы, чтобы обеспечить их пригодность для введения животным до последующих исследований. Преимущество этого подхода заключается в производстве наночастиц, которые повышают биодоступность siRNA и производить наночастицы, которые нейтрально заряжены и, таким образом, пригодны для системного введения. Этот метод является ударным, потому что наночастицы siRNA могут быть применены для лечения множества заболеваний, требующих системного введения, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и аутоиммунные расстройства, среди других.
Для начала растворите полимер в этаноле при концентрации 33,3 миллиграмма на миллилитр и перемешайте, чтобы обеспечить растворение. Затем используйте пипетки для передачи полимерного раствора в 10 миллимолярный буфер лимонной кислоты, чтобы достичь концентрации 3,33 миллиграмма на миллилитр. Добавьте дистиллированную воду в трубку, содержащую небольшую мешащую РНК, чтобы достичь концентрации 50 микромоляров.
Смешайте полимер и небольшие мешающие РНК растворы тщательно в трубке путем трубопроводов вверх и вниз для достижения соотношения азота к фосфатам 10. Поместите трубку при температуре окружающей среды в течение 30 минут. Затем добавьте один миллилитр 10 миллимолярный фосфатный буфер при рН восемь в трубку, чтобы достичь концентрации 0,28 миллиграмма на миллилитр и аккуратно перемешать либо путем пипетки или инвертирования трубки.
Чтобы подтвердить, что окончательный рН является нейтральным, около 7,2 до 7,5, пипетка 10 микролитров малых вмешательства РНК наночастиц раствора на рН тест-полоски. Во-первых, подготовить динамический образец рассеяния света путем фильтрации одного миллилитра малых помех РНК наночастиц при концентрации 0,28 миллиграмма на миллилитр через 0,45-микрометровый пор размер шприца фильтры в квадратный кварц или полистирол кювет. Затем рекордные размеры и измерения поверхностного заряда с помощью динамического инструмента рассеяния света в соответствии со спецификациями производителя.
Для подтверждения размера и морфологии малых мешающихся РНК-наночастиц с помощью электронной микроскопии передачи сначала добавьте пять микролитров фильтрованного малого мешательного раствора РНК-наночастиц по 0,28 миллиграмма на миллилитр к каждой сетке TEM. Поместите сетки при температуре окружающей среды в течение 60 секунд. Пятно сухой с фильтровальной бумагой в течение трех секунд.
Затем добавьте пять микролитров раствора ацетата 3%уранила в каждую сетку и инкубировать в течение 20 секунд. Пятно сухое в течение трех секунд. Затем поместите сетки в децикатор, чтобы высохнуть на ночь перед визуализацией под электронной микроскопией передачи.
Для выполнения агарозы гель отсталости, сначала добавить два грамма электрофорез-класса агарозы порошок 100 миллилитров 1X Tris-ацетат-EDTA буфера на рН восемь в стакане для производства 2%agarose гель. Перемешать, чтобы приостановить агарозу. Поместите стакан обнаружили в микроволновой печи, чтобы нагреть в течение одной-трех минут, пока все агарозы растворяется.
После охлаждения добавьте пять микролитров бромистого этидия при концентрации 10 миллиграммов на миллилитр в стакан и хорошо перемешайте. Затем залить агарозу в гель лоток и место гребень для производства скважин. Дайте гель высохнуть в течение 30 минут.
Аккуратно удалите гребень, чтобы оставить позади погрузки скважин, и залить 1X Tris-ацетат-EDTA буфера в гель лоток для заполнения до максимальной линии заполнения. Затем поместите два микролитерных алицита погрузочного красителя без SDS или уменьшая агентов на парафиновой пленке для каждой небольшой мешательной формулировки РНК-наночастиц при разных соотношениях азота и фосфатов. Пипетку смешать 10 микролитров мелкого раствора РНК-наночастиц с загрузкой красителя на парафиновую пленку.
Добавьте смесь в скважины агарозового геля. Подключите систему электрофореза к источнику питания и запустите источник напряжения на 100 вольт в течение 35 минут или до тех пор, пока образцы не проехав 80% длины геля. Перенесите гель из лотка в уфимский трансиллюминатор и визуализируете небольшие мешающие РНК-полосы на уф-трансиллюминаторе в соответствии со спецификациями производителя.
Определите оптимальное соотношение азота и фосфатов на основе исчезновения небольших мешающихся РНК-полос в нижней части геля. Чтобы сбить модель генной люциферазы, первые семенные люциферазы-выражают клетки в 96-ну черной стеной пластины с DMEM в 10%FBS при плотности 2000 клеток на колодец. Поместите пластину в инкубатор на ночь, чтобы клетки придерживаться.
Утром удалите средства массовой информации и добавьте 10 микролитров на колодец небольших наночастиц РНК, разбавленных в полный сывороточный смил для окончательной небольшой интервокантной концентрации РНК в 100 наномолярных. Верните скважины в инкубатор в течение 24 часов для лечения клеток с небольшими мешать РНК наночастиц. На следующий день замените средства массовой информации полными сывороточной медиа, содержащими 150 микрограмм на миллилитр D-люциферина.
Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение пяти минут, прежде чем измерять люминесценцию на считыватель пластины. Затем повторите освежение средств массовой информации дважды со свежими полными средствами сыворотки, свободными от D-люциферина, а затем инкубации в течение 24 часов. Замените средства массовой информации полными средствами сыворотки, содержащими 150 миллиграммов на миллилитр D-люциферина, и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Измерьте люминесценцию в 48-часовой точке времени. Для продольных исследований оставьте крышку верхней части пластины, когда за пределами шкафа биобезопасности для поддержания клеток в стерильных условиях и продолжить инкубацию после замены люциферин-содержащих средств массовой информации со свежими полными средствами массовой информации. Измерения динамического рассеяния света показывают, что небольшая мешающая РНК-наночастица имеет средний диаметр 35 нанометров.
Наличие одного пика с узкой пиковой шириной указывает на одномодное распределение и низкую полидисперсность. Измерения TEM подтверждают размер измерения от динамического рассеяния света предполагает наличие равномерной популяции малых мешающих РНК наночастиц и показал сферической морфологии малых вмешательства РНК наночастиц. Слишком высокая концентрация полимера на этапе подготовки привела к небольшому вмешательству РНК-наночастицы 2 в нежелательном диаметре более 200 нанометров, мультимодальной и полидисперсной популяции, а также агрегатам в растворе, не образуя отдельной морфологии частиц.
Оба небольших мешая наночастицы РНК один и два отображения нейтрального поверхностного заряда, указанного почти нулевым средним zeta потенциальных значений. Анализ отсталости геля агарозы показывает исчезновение небольших мешателей РНК-полос на гель-дне, что указывает на у сложности небольшой интерфузной РНК с полимером. Полимерная сложная небольшая мешаемая РНК не может мигрировать через гель и, таким образом, визуализируется в верхней части геля рядом с погрузочными скважинами.
По мере увеличения соотношения азота к фосфатам увеличивается небольшая интерструляция РНК, о чем свидетельствует снижение интенсивности небольшой мешаемой РНК-полосы на дне геля. Биоактивная люцифераза малых вмешательства РНК наночастицы один экспонатов значительно уменьшилась активность люциферазы по сравнению с скремблированный контроль. В отличие от этого, люцифераза малых вмешательства РНК наночастицы два не считается биоактивным.
Для получения последовательных наночастиц siRNA с желаемыми физикохимическими свойствами следует использовать полимерные растворы с соответствующими концентрациями и проверять рН буферных решений на каждом этапе протокола. Используя эти методы в наших исследованиях, мы смогли производить наночастицы siRNA на основе терапии для ранее неопровожимых генов, вызывающих рак, и проверить эффективность этих методов лечения в доклинических моделях рака молочной железы.
