Этот метод представляет собой способ создания эшафотов, полученных из родной ткани, которые могут быть использованы для регенерации хряща. Основным преимуществом этой техники является то, что компоненты родного хряща сохраняются в лесах, которые могут способствовать образованию хряща и регенерации в пробирке и in vivo. Хотя этот метод использует хрящ из лошадей душить суставы, хрящ из любых других суставов могут быть использованы, а также.
Для начала, получить нетронутыми трупных суставов для изоляции хряща и удалить кожу избыток жира и мышечной ткани, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Далее определите место, где сустав артикулирует, выполняя расширение перегиба сустава. Сделайте горизонтальный разрез, чтобы достичь полости сустава.
Затем сделайте вертикальный разрез, чтобы открыть область сустава. Полость сустава заполнена синовиальной жидкостью, которая, скорее всего, капает из полости при выполнении правильного разреза. Продолжайте открывать сустав полностью, удалив чрезмерное жира, мышц и сухожилий, и путем разрезания через сухожилия, которые держат сустав вместе.
Тщательно осмотрите хрящ на любые макроскопические повреждения. Если суставной хрящ не имеет глянцевый гладкий внешний вид или если доказательства, пузыри, расщелины или дефекты присутствуют, отбросить хрящ и начать все сначала. Используйте стерильный скальпель, чтобы удалить хрящ из кости.
Вырезать весь путь до подхондриальной кости, чтобы удалить глубокий хрящ зоны. Соберите удаленные ломтики хряща в 50 миллилитровых трубках, содержащих ранее подготовленный раствор для мытья хряща. Во время обработки, регулярно капельного раствора для мытья хряща на хрящ, чтобы предотвратить высыхание хряща.
После сбора хряща из всех областей, представляющих интерес, оснастки заморозить ломтики хряща в жидком азоте в течение пяти минут. Затем перенесите ломтики хряща в 50 миллилитровых трубок и сразу же поместить замороженные ломтики в сушилку для замораживания. Лиофилизировать ломтики хряща в течение 24 часов с феном.
После завершения, хранить заморозить сушеные ломтики хряща в сухом месте при комнатной температуре. Для ручной обработки, предварительно охладить раствор и пестик с жидким азотом, а затем поместить лиофилизированные ломтики хряща в раствор и погрузить их и жидкого азота. Непосредственно измельчить образцы вручную в течение примерно 45 минут, пока они не будут достаточно распылены.
Кроме того, чтобы измельчить образцы автоматически с помощью фрезерной машины, начните с предварительного охлаждения шлифовального отсека фрезерной машины путем добавления жидкого азота. Затем добавьте ломтики лиофилинизированного хряща и измельчите образец на заданной скорости в течение нескольких секунд до минуты. Убедитесь, что все частицы измельчены и что частицы не остаются в нижней части шлифовального отсека.
Наконец, следуйте вместе с методом децеллюляризации, описанным в сопроводительном текстовом протоколе до формирования лесов. Перенесите частицы хряща с небольшой этикеткой в цилиндрическую пластиковую форму. Нажмите все пузырьки воздуха, чтобы избежать полостей в эшафот и заполнить форму полностью.
Чтобы избежать полостей в лесах, убедитесь, что пузырьки воздуха выдавливаются при заполнении формы частицами хряща. После образования заморозьте форму на 10 минут при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Затем лиофилизировать хрящ леса в форме в течение 24 часов в заморозить сушилку.
После лиофилизации, тщательно удалить эшафот из формы. Поместите эшафот под 365 нанометров длиной волны УФ-излучения и пересечь связь его в одночасье. Форма эшафот диски путем резки стерилизованных лесов на три миллиметра толщиной ломтиками.
Затем перенесите эшафоты в отдельные wellS из шести хорошо пластины. Добавьте один миллилитр chondrocyte расширение среднего на верхней части леса и дайте им регидратировать в течение 30 минут. В то время как леса регидратировать, подготовить клетки и пипетки 50 микролитер подготовленной подвески ячейки на вершине предварительно пропитанной эшафот.
Затем инкубировать эшафот в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию. При использовании хондроцитов убедитесь, что они не были расширены мимо первого прохода, чтобы свести к минимуму количество дифференцированных клеток. Через час верните тарелку в культурный капюшон и аккуратно переверните эшафот.
Pipette оставшиеся 50 микролитров клеточной подвески на эшафот и инкубировать еще час при 37 градусов по Цельсию. После инкубации добавьте три миллилитров среднего к колодцам со строительными лесами. Избегайте пипетки среды непосредственно на лесах и обрабатывать культуру пластины мягко, чтобы избежать отслоения клеток.
Верните тарелку в инкубатор и культурную ячейку, утехив от эшафотов при 37 градусах по Цельсию. Сочетание гистологического окрашивания и количественной оценки ДНК были использованы, чтобы показать, что методы, представленные в этой статье приводят к достаточной децеллюляризации хряща леса. В результате были обнаружены строительные леса, которые не содержат клеток наряду с необнаруживаемыми уровнями ДНК.
Они также не хватает гликозаминогликанов и богаты коллагеном II.Here, нео матричное образование наблюдается на эшафот уренечен мезенхимальных стволовых клеток, которые были культурны в течение четырех недель. Формирование гликозаминогликанов в изобилии после четырех недель. После попытки этой процедуры, важно изучить, является ли децеллюляризация была успешной, прежде чем использовать его в любом приложении.
После этой процедуры может быть проведен дополнительный биохимический анализ, такой как западный анализатор помарки, чтобы ответить на конкретные вопросы о наличии других компонентов, таких как факторы роста. Этот метод проложил путь для исследователей в области тканевой инженерии для изучения стратегий регенерации хряща с использованием децеллюлярных тканей из аллогенных и сингенных источников. Такие меры предосторожности, как ношение лабораторного пальто и перчаток, всегда должны приниматься.
