Этот метод обеспечивает бесплатный доклинический подход для изучения немедленной клеточной реакции на кровь в головном мозге после геморрагического инсульта, очень серьезное состояние, для которого у нас нет конкретных лекарств для пациентов. В отличие от моделей грызунов, прозрачность личинок зебры позволяет наблюдать клеточные реакции в мозге живых нетронутых животных в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Для начала используйте чайный ситечко для сбора всех оплодотворенных эмбрионов от естественного нереста в племенных коробках, произведенных из одного самца и от одного до двух взрослых зебр.
Перенесите 100 эмбрионов в каждую чашку Петри, содержащую стандартную среду эмбриона Е3. Инкубация при 28 градусах по Цельсию и этап в соответствии со стандартными руководящими принципами. В шесть часов после оплодотворения, удалить мертвые и неудобренные эмбрионы из блюда с помощью пастер пипетки и положить посуду обратно в инкубатор.
В течение 24 часов после оплодотворения, под стерео микроскопом яркого поля, используйте острые ультратонкие миппы вскрытия для декорации эмбрионов для лечения аторвастатина. Затем добавьте 30 миллилитров эмбриона E3 среднего до двух чистых блюд Петри, один для лечения, а другой для контроля. Удалить 60 микролитров воды эмбриона из лечения блюдо и добавить 60 микролитров 0,5 миллимолярный аторвастатин для достижения 80% личинок кровоизлияния.
Используя пипетку Pasteur, перенесите 100 эмбрионов в как можно меньше воды к каждому блюду. Инкубировать два блюда при 28 градусах по Цельсию. В любое время после 50 часов после оплодотворения, под микроскопом используйте пипетку Pasteur, чтобы тщательно отделить кровоизлияние рыбы от неморрагивных популяций и перенести личинки на новые блюда, содержащие свежие средства массовой информации E3.
Чтобы облегчить отделить кровоизлияние положительных личинок, можно использовать рыбу без пигмента или рыбы, которые выражают флуоресцентный белок в красных кровяных телец. На третий день под флуоресцентным микроскопом экран личинки обеспечивают экспрессию флуоресцентного белка. Затем заполните световую камеру монтажа листа с E3 сми, содержащей 0,2%MS-222 для анестезии.
Используя трубу Pasteur, перенесите одну каплю, содержащую от одной до шести личинок, на сухую поверхность чашки Петри для монтажа. Используйте пипетку, чтобы удалить как можно больше жидкости. Добавить падение 1,5%низкий расплава агарозы от 45 градусов по Цельсию тепловой блок для личинок и использовать 800 микрометров монтажа капилляров, чтобы привлечь личинок вверх головой в первую очередь.
Если позиционирование не является точным, изгнать личинки из агарозы и смонтировать снова. Оставьте капилляр остыть, а затем вставьте в камеру светлого листа. На программное обеспечение для визуализации ЗЕН, нажмите непрерывно, чтобы сориентировать личинки и нажмите приобрести приобрести z-стек изображения головы между линзами глаз.
В вкладке обработки создайте изображение проекции максимальной интенсивности из каждого z-стека. Чтобы случайным образом выбрать для анализа подвижности, перенесите 24 личинки после анестезии в свежие средства массовой информации E3 и позвольте животным оправиться от анестезии. После того, как личинки полностью оправились от анестезии, используя пипетки с конца вырезать передачи восстановленных личинок в E3 среды без метиленового синего.
Плита одна личинка в один миллилитр на колодец 24 хорошо пластины. Загрузите пластину в камеру камеры. В программном обеспечении отслеживания EthoVision XT отрегулируйте настройки эксперимента, чтобы настроить режим белого света, чтобы увеличить спонтанное плавание и движение анализа в течение 10 минут.
Повторите анализ передвижения в 96 и 120 часов после оплодотворения. Оценка смерти клеток головного мозга с помощью трансгенного убиквитина, секретированная венозной линией репортера Annexin V M, приводит к тому, что явные скопления умирающих клеток в кровоизлияниях личинок, которые отсутствуют во всех неморрагальных личинках, показанных зелеными флуоресценциями, свидетельствуют о наличии кровотечений в головном мозге. Умирающие клетки наблюдались как в моделях аторвастатина, так и в моделях головок пузырьков для кровоизлияния личинок.
Морфология MPEG1 положительные макрофаги изменения во внутримозговых кровоизлияния положительных личинок, как клетки принимают в активной округлой форме амебоидов. Эти активированные округлые клетки были проверены с течением времени, чтобы показать повышенную фагоцитическую реакцию убиквитина, секретного Annexin V M венозного выражения умирающих клеток во внутримозговых кровоизлияниях положительных личинок. Кровоизлияние в мозг связано со значительным снижением подвижности на 72 и 96 часов после оплодотворения по сравнению с внутримозгового кровоизлияния отрицательный контроль брата и сестры.
Подвижность в 120 часов после оплодотворения восстанавливается почти до базового уровня. Наиболее важным аспектом этой процедуры является обязательно тщательно изучить личинки на наличие или отсутствие кровоизлияний в мозг, прежде чем приступить к фенотипирование анализов. Эта модель также может быть использована для скрининга наркотиков, чтобы определить, если фенотип тяжести может быть улучшена после кровотечения, подход, который может привести нас к выявлению новых кандидатов наркотиков в будущем.
Этот метод позволяет нам исследовать клеточные реакции сразу после кровотечения в мозге в течение точки времени, которая была так печально известно трудно изучить до сих пор. Хотя ни один из реагентов или инструментов, описанных в этом протоколе, не является особо опасным, стандартная осторожность и меры предосторожности должны приниматься во время использования химических веществ, острых или лазеров.
