この方法は、出血性脳卒中後の脳内の血液に対する即時の細胞応答を研究するための無料の前臨床アプローチを提供する。げっ歯類モデルとは異なり、ゼブラフィッシュの幼虫の透明性により、生きた無傷の動物の脳内の細胞反応を蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで観察することができます。まず、ティーストレーナーを使用して、1人の雄と1〜2匹の雌の成虫ゼブラフィッシュから生産された繁殖箱の生産卵からすべての受精胚を収集します。
標準的なE3胚培地を含む各ペトリ皿に100個の胚を移す。標準ガイドラインに従って摂氏28度でインキュベートし、ステージを行います。受精後6時間で、パスツールピペットを使用して皿から死んだ胚と未受精胚を取り除き、食器を保育器に戻します。
受精後24時間で、明視野ステレオ顕微鏡の下で、鋭い超薄解離鉗子を使用して、アトルバスタチン治療のために胚を装飾します。その後、2つのきれいなペトリ皿に30ミリリットルのE3胚培地を加え、1つは治療用、もう1つはコントロール用です。治療皿から60マイクロリットルの胚水を取り除き、0.5ミリモルアトルバスタチンの60マイクロリットルを加えて、幼虫出血の80%を達成する。
パスツールピペットを使用して、各皿にできるだけ少ない水で100個の胚を移します。2つの料理を摂氏28度でインキュベートします。受精後50時間後、顕微鏡ではパスツールピペットを使用して、出血した魚を非出血集団から慎重に分離し、幼虫を新鮮なE3培地を含む新しい料理に移します。
出血陽性の幼虫を分離しやすくするために、赤血球中の蛍光タンパク質を発現する顔料や魚を使わずに魚を使うことができます。3日目には、蛍光顕微鏡下で幼虫をスクリーニングし、蛍光タンパク質の発現を確実にする。次に、麻酔用に0.2%MS-222を含むE3メディアでライトシート取り付けチャンバーを充填します。
パスツールピペットを使用して、1〜6匹の幼虫を含む単一の液滴を乾燥したペトリ皿表面に移して取り付けます。できるだけ多くの液体を除去するためにピペットを使用してください。45°Cの熱ブロックから幼虫に1.5%低溶融アガロースの低下を加え、800マイクロメートルの取り付け毛細管を使用して最初に幼虫の頭を引き上げる。
位置決めが正確でない場合は、幼虫をアガロースから追い出し、再度取り付ける。キャピラリーを冷却したままにしてから、ライトシートチャンバーに挿入します。ZENイメージングソフトウェアでは、連続して幼虫の向きを調整し、取得してアイレンズ間の頭部のZスタック画像を取得します。
処理タブで、各 z スタックから最大強度投影イメージを生成します。運動性アッセイを無作為に選択するには、麻酔後の24匹の幼虫を新鮮なE3培地に移し、動物が麻酔から回復することを可能にする。幼虫が麻酔から完全に回復した後、末端切り替えでピペットを使用して、メチレンブルーなしでE3培地に幼虫を回復した。
24ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルに1つの幼虫をプレートします。プレートをカメラチャンバーに積み込みます。EthoVision XTトラッキングソフトウェアでは、実験設定を調整して、自発的な水泳とアッセイのモーションを10分間増加させる白色光の驚くべきルーチンを設定します。
96時間と120時間後の受精後に移動アッセイを繰り返します。トランスジェニックユビキチン分泌型アキシンV M静脈レポーターラインを用いた脳細胞死の評価は、緑色蛍光によって示されたすべての非出血性幼虫に存在しない出血性幼虫中の死にかけている細胞の明確なクラスターをもたらす明るい視野画像は、脳出血の存在を示す。死にかけている細胞は、出血した幼虫のアトルバスタチンおよび気泡頭モデルの両方で観察された。
MPEG1陽性マクロファージの形態は、細胞が活性な丸みを帯びたアメーバ形状で採用するとして、脳内出血陽性幼虫の変化を示す。これらの活性化された丸みを帯びた細胞を、脳内出血陽性幼虫における死死細胞を発現するユビキチン分泌型アネキチンV M静脈の貪食応答の増加を示すために、時間をかけてモニタリングした。脳出血は、脳内出血陰性兄弟対照と比較して、受精後72時間および96時間で運動性の有意な減少に関連している。
受精後120時間の運動性はベースラインに近いレベルに回復する。この手順の最も重要な側面は、予言アッセイに進む前に、脳出血の有無について幼虫を徹底的に調べることである。このモデルは、出血後に表現型の重症度を改善できるかどうかを判断するための薬物スクリーニングにも使用でき、将来的に新しい薬剤候補を特定する可能性があります。
この技術は、私たちは今まで研究することが非常に悪名高い時点で脳内出血の直後に細胞応答を探索することができます。このプロトコルに記載されている試薬や機器は特に危険ではありませんが、化学物質、シャープ、レーザーを使用する場合は常に、標準的な注意と予防措置を講じる必要があります。
