Bu yöntem, hemorajik inme sonrasında beyinde kana hemen hücresel yanıt eğitimi için ücretsiz bir ön klinik yaklaşım sağlar, hangi biz hastalar için mevcut özel ilaçlar var çok ciddi bir durum. Kemirgen modellerinin aksine, zebra balığı larvalarının şeffaflığı, floresan mikroskopi kullanarak canlı hayvanların beyinlerindeki hücresel tepkileri gerçek zamanlı olarak gözlemlememizi sağlar. Başlamak için, bir erkek ve bir ila iki dişi yetişkin zebra balığı ndan üretilen üreme kutularında doğal yumurtlama tüm döllenmiş embriyoları toplamak için bir çay süzgeci kullanın.
Standart E3 embriyo ortamı içeren her Petri kabına 100 embriyo aktarın. 28 santigrat derecede kuluçka ve standart kurallara göre sahne. Döllenmeden altı saat sonra, pasteur pipeti kullanarak ölü ve döllenmemiş embriyoları yemekten çıkarın ve bulaşıkları kuvöze geri koyun.
24 saat sonra, parlak alan stereo mikroskop altında, Atorvastatin tedavisi için embriyoları decorionate keskin ultra ince diseksiyon forsepsi kullanın. Sonra iki temiz Petri yemekleri, bir tedavi ve kontrol için diğer E3 embriyo orta 30 mililitre ekleyin. Tedavi çanak embriyo su 60 mikrolitre çıkarın ve larva kanamalı% 80 elde etmek için 0.5 milimolar Atorvastatin 60 mikrolitre ekleyin.
Pasteur pipeti kullanarak, her çan ağa mümkün olduğunca az su 100 embriyo transfer. İki tabak 28 santigrat derece kuluçka. Gübrelemeden 50 saat sonra herhangi bir zamanda, mikroskop altında, kanamalı balıkları kanamasız popülasyonlardan dikkatlice ayırmak ve larvaları taze E3 ortam içeren yeni yemeklere aktarmak için pasteur pipetkullanın.
Daha kolay kanama pozitif larvaayırmak için, kırmızı kan hücrelerinde floresan protein ifade pigment veya balık olmadan balık kullanabilirsiniz. Üçüncü gün, floresan mikroskop ekranında floresan proteinin ekspresyonunu sağlamak için larvalar kullanılır. Daha sonra anestezi için %0,2 MS-222 içeren E3 ortamile hafif sac montaj odasını doldurun.
Pasteur pipeti kullanarak, 1-6 larva içeren tek bir damlacığı montaj için kuru petri kabı yüzeyine aktarın. Mümkün olduğunca çok sıvı kaldırmak için bir pipet kullanın. Larvalara 45 derece santigrat ısı bloğundan %1,5'lik düşük erime agarose'u ekleyin ve larvaları baş yukarı çekmek için 800 mikrometrelik bir kapiller kullanın.
Konumlandırma doğru değilse, larvaları agarose'dan uzaklaştırın ve tekrar monte edin. Kapiller soğumaya bırakın ve sonra ışık levha odasına takın. ZEN görüntüleme yazılımında larvaları yönlendirmek için sürekli basın ve göz merceği arasında kafanın z-yığın görüntülerini elde etmek için elde edin.
İşlem sekmesinde, her z yığınından maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntüsü oluşturun. Motilite testi için rastgele seçmek için, anesteziden sonra 24 larvayı taze E3 ortama aktarın ve hayvanların anesteziden kurtulmasını bekleyin. Larvalar anesteziden tamamen iyileştikten sonra, son kesme transferi ile bir pipet kullanarak metilen mavisi olmadan E3 ortamına geri kazanılmış larvalar.
24 kuyu plakası kuyubaşına bir mililitrede bir larva plakası. Plakayı kamera odasına yükleyin. EthoVision XT izleme yazılımında, spontan yüzme ve deneme hareketini 10 dakika artırmak için beyaz ışık ürktülü rutini ayarlamak için deneme ayarlarını ayarlayın.
96 ve 120 saat post-fertilizatin de lokomotion tsay tekrarlayın. Transgenik ubiquitin salgılanan Annexin V M venöz muhabir hattı kullanılarak beyin hücresi ölümünün değerlendirilmesi, yeşil floresan parlak alan görüntüleri ile gösterilen tüm kanamasız larvalarda bulunmayan kanamalı larvalarda kesin ölüm hücre kümeleri ile sonuçlanır Parlak alan görüntüleri beyin kanamalarının varlığını göstermektedir. Kanamalı larvalar için hem Atorvastatin hem de kabarcık kafa modellerinde ölen hücreler gözlendi.
MPEG1 pozitif makrofajların morfolojisi intraserebral kanama pozitif larvalarda hücreler aktif yuvarlak amipoid şekil olarak benimsemiştir. Bu aktif yuvarlak hücreler intraserebral kanama pozitif larvalarda ölmekte olan hücreleri ifade eden ubikitin salgılanan Annexin V M venözlerin fagositik yanıtını göstermek için zaman içinde izlendi. Beyin kanaması intraserebral kanama negatif kardeş kontrolleri ile karşılaştırıldığında 72 ve 96 saat post-fertilizasyon de motilite önemli bir azalma ile ilişkilidir.
Döllenme sonrası 120 saat olan hareketlilik, temel seviyelere yakın bir düzeye geri kazanışır. Bu işlemin en önemli yönü iyice fenomeni ilerkileme tahlilleri geçmeden önce beyin kanamaları varlığı veya yokluğu için larva incelemek için emin olmaktır. Bu model aynı zamanda fenotip şiddetinin kanamadan sonra iyileşip iyileşmeyebileceğini belirlemek için ilaç taraması için de kullanılabilir, bu da gelecekte yeni ilaç adaylarını belirlememize yol açabilecek bir yaklaşımdır.
Bu teknik bize şimdiye kadar çok kötü üne sahip şimdi çalışma zor olmuştur bir zaman noktası sırasında beyinkanamasından hemen sonra hücresel yanıtları keşfetmek için izin verir. Bu protokolde tanımlanan reaktiflerin veya aletlerin hiçbiri özellikle tehlikeli olmamasına rağmen, kimyasallar, keskin ler veya lazerler kullanılarak her zaman standart bakım ve önlemler alınmalıdır.
