이 방법은 출혈성 뇌졸중 후 뇌의 혈액에 대한 즉각적인 세포 반응을 연구하기위한 무료 전 임상 접근법을 제공합니다. 설치류 모델과 는 달리, 제브라피시 애벌레의 투명성은 형광 현미경 을 사용하여 실시간으로 살아있는 동물의 뇌 내에서 세포 반응을 관찰 할 수 있습니다. 시작하려면 차 여과기를 사용하여 한 남성과 1 ~2 명의 여성 성인 제브라피시에서 생산 된 사육 상자에서 천연 산란에서 모든 수정 된 배아를 수집하십시오.
표준 E3 배아 배지를 함유한 각 페트리 접시에 100개의 배아를 전달한다. 표준 지침에 따라 섭씨 28도에서 배양하고 스테이지를 진행합니다. 수정 후 6시간 동안 파스퇴르 파이펫을 사용하여 접시에서 죽은 배아와 수정되지 않은 배아를 제거하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
24 시간 후 수정, 밝은 필드 스테레오 현미경에서, 아토르 바스타틴 치료에 대 한 배아를 탈경 하기 위해 날카로운 초박형 집게를 사용 하 여. 그런 다음 E3 배아 배지 30밀리리터를 두 개의 깨끗한 페트리 접시에 추가하면, 하나는 치료를 위해, 다른 하나는 대조를 이시합니다. 처리 접시에서 배아 물 60 마이크로리터를 제거하고 애벌레 출혈의 80 %를 달성하기 위해 0.5 밀리머라 아토르 바스타틴의 60 마이크로 리터를 추가합니다.
파스퇴르 파이펫을 사용하여 100개의 배아를 각 접시에 가능한 한 적은 물에 옮기습니다. 섭씨 28도에서 두 가지 요리를 배양하십시오. 수정 후 50시간 후 언제든지 현미경으로 파스퇴르 파이펫을 사용하여 출혈이 없는 집단에서 출혈을 조심스럽게 분리하고 애벌레를 신선한 E3 미디어를 함유한 새로운 요리로 옮습니다.
출혈 양성 애벌레를 쉽게 분리하기 위해 적혈구에서 형광 단백질을 표현하는 안료 나 물고기없이 물고기를 사용할 수 있습니다. 셋째 날, 형광 현미경으로 유충을 검사하여 형광 단백질의 발현을 보장합니다. 그런 다음 광시트 장착 챔버를 0.2%MS-222를 함유한 E3 용지로 채우면 마취를 한다.
파스퇴르 파이펫을 사용하여 1-6개의 애벌레가 들어 있는 한 방울을 건조 페트리 접시 표면에 전달하여 장착합니다. 파이펫을 사용하여 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 45도의 낮은 용융 아가로즈를 애벌레에 넣고 800 마이크로미터 장착 모세관을 사용하여 유충을 먼저 끌어올립니다.
포지셔닝이 정확하지 않은 경우 아가로즈에서 애벌레를 추방하고 다시 마운트하십시오. 모세관을 식힌 다음 라이트 시트 챔버에 삽입하십시오. ZEN 이미징 소프트웨어에서, 애벌레의 방향을 지정하고 눈 렌즈 사이의 헤드의 z 스택 이미지를 얻기 위해 획득을 누르기 위해 연속프레스.
처리 탭에서 각 z 스택에서 최대 강도 투영 이미지를 생성합니다. 운동성 분석기를 무작위로 선택하려면 마취 후 24개의 애벌레를 신선한 E3 매체로 옮기고 동물이 마취에서 회복할 수 있도록 합니다. 애벌레가 마취에서 완전히 회복된 후, 말단 절단 이체가 있는 파이펫을 사용하여 메틸렌 블루없이 E3 배지로 유충을 회수하였다.
24 웰 플레이트의 우물 당 1 밀리 리터에 하나의 애벌레를 접시. 플레이트를 카메라 챔버에 로드합니다. EthoVision XT 추적 소프트웨어에서 실험 설정을 조정하여 백색 광 깜짝 루틴을 설정하여 10분 동안 자발적인 수영 및 분석 동작을 늘립니다.
96 및 120 시간 후 fertilizatin에서 운동 분석을 반복합니다. 형질비퀴틴분비체를 이용한 뇌세포 사망 평가는 녹색 형광브라이트필드 영상에 의해 표시된 모든 비출혈유충에 결석한 출혈성 애벌레에서 죽어가는 세포의 명확한 클러스터를 생성한다. 죽어가는 세포는 출혈유충에 대한 아토르바스타틴 과 버블 헤드 모델 모두에서 관찰되었다.
MPEG1 양성 대식세포의 형태는 세포가 활성 둥근 아모에이드 모양으로 채택함에 따라 인트레이스 역골 출혈 양성 애벌레의 변화입니다. 이러한 활성화된 둥근 세포는 시간이 지남에 따라 모니터링되어 유비퀴틴분비체 의 증가된 식세포 반응을 나타내기 위해 서마레뇌 출혈 양성 애벌레에서 죽어가는 세포를 발현하는 유비퀴틴 V M 정맥의 증가된 식세포 반응을 나타내었다. 뇌 출혈은 72 및 96 시간 후 수정 후 운동성에 있는 유의한 감소와 연관됩니다.
120시간 후 수정시 운동성은 기준선 수준에 가깝게 회복됩니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 현상금 표고 를 진행하기 전에 뇌 출혈의 존재 또는 부재에 대한 애벌레를 철저히 검사하는 것입니다. 이 모형은 또한 현상형 엄격이 출혈 후에 향상될 수 있는지 결정하기 위하여 약 검열을 위해 이용될 수 있습니다, 미래에 새로운 약 후보를 확인하기 위하여 저희를 이끌어 낼 수 있는 접근.
이 기술은 우리가 지금 전에 공부하기 위하여 이렇게 악명 높게 어려웠던 시간 점 도중 두뇌에 있는 출혈 후에 즉시 세포 반응을 탐구하는 것을 허용합니다. 이 프로토콜에 설명된 시약이나 계측기는 특별히 위험하지 않지만 화학 물질, 날카로운 또는 레이저를 사용할 때마다 표준 관리 및 예방 조치를 취해야 합니다.
