Este método fornece uma abordagem pré-clínica complementar para estudar a resposta celular imediata ao sangue no cérebro após um derrame hemorrágico, uma condição muito grave para a qual não temos medicamentos específicos disponíveis para os pacientes. Ao contrário dos modelos de roedores, a transparência das larvas de zebrafish nos permite observar respostas celulares dentro do cérebro de animais vivos intactos em tempo real usando microscopia fluorescente. Para começar, use um coador de chá para coletar todos os embriões fertilizados da desova natural em caixas de reprodução produzidas de um macho e um para dois zebrafish adultos fêmeas.
Transfira 100 embriões para cada placa de Petri contendo o meio padrão de embrião E3. Incubar a 28 graus Celsius e estágio de acordo com as diretrizes padrão. Às seis horas após a fertilização, remova embriões mortos e não fertilizados do prato usando uma pipeta Pasteur e coloque os pratos de volta na incubadora.
Às 24 horas após a fertilização, sob um microscópio estéreo de campo brilhante, use fórceps de dissecção ultra fina afiados para decorionar embriões para o tratamento com Atorvastatina. Em seguida, adicione 30 mililitros de embrião E3 médio a duas placas de Petri limpas, uma para tratamento e outra para controle. Remova 60 microliters de água embrionária do prato de tratamento e adicione 60 microlitadores de 0,5 mililitro atorvastatina para alcançar 80% das larvas hemorrágicas.
Usando uma pipeta Pasteur, transfira 100 embriões em tão pouca água quanto possível para cada prato. Incubar os dois pratos a 28 graus Celsius. A qualquer momento após 50 horas após a fertilização pós-fertilização, sob o microscópio use uma pipeta Pasteur para separar cuidadosamente peixes hemorragados de populações não-hemorrhaged e transferir as larvas para novos pratos contendo mídia E3 fresca.
Para facilitar a separação de larvas positivas de hemorragia, você poderia usar peixes sem pigmento ou peixes que expressam proteína fluorescente em glóbulos vermelhos. No terceiro dia, sob uma tela de microscópio fluorescente, as larvas para garantir a expressão da proteína fluorescente. Em seguida, encha a câmara de montagem da folha de luz com mídia E3 contendo 0,2%MS-222 para anestesia.
Usando uma pipeta Pasteur, transfira uma única gota contendo uma a seis larvas para uma superfície seca da placa de Petri para montagem. Use uma pipeta para remover o máximo de líquido possível. Adicione uma queda de 1,5% de derretimento baixo agarose do bloco de calor de 45 graus Celsius para as larvas e use um capilar de montagem de 800 micrômetros para desenhar as larvas de cabeça erguida primeiro.
Se o posicionamento não for preciso, expulse as larvas da agarose e monte novamente. Deixe o capilar esfriar e depois insira na câmara da folha de luz. No software de imagem ZEN, pressione continuamente para orientar as larvas e pressione a aquisição para adquirir imagens de pilha de z da cabeça entre as lentes dos olhos.
Na guia de processamento, gere uma imagem de projeção de intensidade máxima a partir de cada pilha z. Para selecionar aleatoriamente para o ensaio de motilidade, transfira 24 larvas após anestesia para mídia E3 fresca e permita que os animais se recuperem da anestesia. Após as larvas terem se recuperado totalmente da anestesia, usando uma pipeta com a transferência final, as larvas recuperadas para o meio E3 sem azul de metileno.
Placa uma larva em um mililitro por poço de uma placa de 24 poços. Coloque a placa na câmara da câmera. No software de rastreamento EthoVision XT, ajuste as configurações do experimento para configurar uma rotina de desotimaçamento de luz branca para aumentar o movimento de natação espontânea e ensaio por 10 minutos.
Repita o ensaio de locomoção às 96 e 120 horas após a fertilização. A avaliação da morte celular cerebral usando uma ubiquitina transgênica secretada anexada V M linha de repórteres venosos resulta em claros aglomerados definitivos de células moribundas em larvas hemorrágicas que estão ausentes em todas as larvas não-hemorrhaged indicadas por imagens de campo brilhante fluorescência verde demonstram a presença de sangramentos cerebrais. Células moribundas foram observadas tanto em modelos de atorvastatina quanto em cabeças de bolha para larvas hemorrhaged.
A morfologia dos macrófagos positivos MPEG1 altera em larvas positivas de hemorragia intracerebral à medida que as células adotam em forma de ameboide arredondado ativo. Estas células arredondadas ativadas foram monitoradas ao longo do tempo para mostrar uma resposta fagocítica aumentada da ubiquitina secretada Anexan V M venosa expressando células moribundas em larvas positivas de hemorragia intracerebral. A hemorragia cerebral está associada a uma diminuição significativa da motilidade em 72 e 96 horas após a fertilização em comparação com os controles negativos da hemorragia intracerebral.
A motilidade em 120 horas após a fertilização se recupera para níveis próximos da linha de base. O aspecto mais importante deste procedimento é ter certeza de examinar minuciosamente as larvas para a presença ou ausência de hemorragias cerebrais antes de prosseguir para os ensaios fenotínuos. Este modelo também pode ser usado para a triagem de medicamentos para determinar se a gravidade do fenótipo pode ser melhorada após uma hemorragia, uma abordagem que pode nos levar a identificar novos candidatos a medicamentos no futuro.
Esta técnica nos permite explorar as respostas celulares imediatamente após uma hemorragia no cérebro durante um ponto de tempo que tem sido tão notoriamente difícil de estudar até agora. Embora nenhum dos reagentes ou instrumentos descritos neste protocolo sejam especificamente perigosos, os cuidados e precauções padrão devem ser tomados em todo o tempo usando produtos químicos, afiados ou lasers.
