Este método proporciona un enfoque preclínica gratuito para estudiar la respuesta celular inmediata a la sangre en el cerebro después de un accidente cerebrovascular hemorrágico, una condición muy grave para la cual no tenemos medicamentos específicos disponibles para los pacientes. A diferencia de los modelos de roedores, la transparencia de las larvas de pez cebra nos permite observar las respuestas celulares dentro del cerebro de animales vivos intactos en tiempo real utilizando microscopía fluorescente. Para comenzar, utilice un colador de té para recoger todos los embriones fertilizados del desove natural en cajas de reproducción producidas a partir de un macho y de una a dos hembras de peces cebra adultos.
Transfiera 100 embriones a cada plato Petri que contenga el medio embrionario E3 estándar. Incubar a 28 grados centígrados y escenificar de acuerdo con las pautas estándar. A las seis horas después de la fertilización, retire los embriones muertos y no fecundados del plato con una pipeta Pasteur y vuelva a colocar los platos en la incubadora.
A las 24 horas después de la fertilización, bajo un microscopio estéreo de campo brillante, utilice fórceps de disección ultradelgadas afiladas para decorionar embriones para el tratamiento con atorvastatina. A continuación, añadir 30 mililitros de medio embrionario E3 a dos platos Limpios de Petri, uno para el tratamiento y el otro para el control. Retire 60 microlitros de agua embrionaria de la placa de tratamiento y agregue 60 microlitros de 0,5 mililitrolas de atorvastatina para lograr el 80% de la hemorragia de larvas.
Con una pipeta Pasteur, transfiera 100 embriones en la menor agua posible a cada plato. Incubar los dos platos a 28 grados centígrados. En cualquier momento después de 50 horas después de la fertilización, bajo el microscopio utilizar una pipeta Pasteur para separar cuidadosamente el pescado con hemorragia de poblaciones no hemorragias y transferir las larvas a nuevos platos que contengan medios frescos E3.
Para facilitar la separación de las larvas positivas por hemorragia, podrías usar peces sin pigmento o pescado que expresen proteína fluorescente en los glóbulos rojos. Al tercer día, bajo un microscopio fluorescente criba las larvas para asegurar la expresión de proteína fluorescente. A continuación, llene la cámara de montaje de la hoja de luz con medios E3 que contengan 0,2%MS-222 para la anestesia.
Con una pipeta Pasteur, transfiera una sola gota que contenga de una a seis larvas a una superficie seca de la placa Petri para su montaje. Utilice una pipeta para eliminar tanto líquido como sea posible. Agregue una gota de 1.5% de agarosa de fusión baja del bloque de calor de 45 grados Celsius a las larvas y utilice un capilar de montaje de 800 micrómetros para atraer primero la cabeza de las larvas.
Si el posicionamiento no es preciso, expulse las larvas de la agarosa y vuelva a montarla. Deje que el capilar se enfríe y luego insértelo en la cámara de la lámina de luz. En el software de imágenes ZEN, presione continuamente para orientar las larvas y la prensa adquiera para adquirir imágenes de la cabeza de la cabeza entre las lentes oculares.
En la pestaña de procesamiento, genere una imagen de proyección de intensidad máxima a partir de cada pila z. Para seleccionar aleatoriamente el ensayo de motilidad, transfiera 24 larvas después de la anestesia a medios E3 frescos y permita que los animales se recuperen de la anestesia. Después de que las larvas se hayan recuperado completamente de la anestesia, utilizando una pipeta con el corte final transferir larvas recuperadas en E3 medio sin azul de metileno.
Placa una larva en un mililitro por pozo de un plato de 24 pozos. Cargue la placa en la cámara de la cámara. En el software de seguimiento EthoVision XT, ajuste la configuración del experimento para configurar una rutina de inicio de luz blanca para aumentar el movimiento espontáneo de natación y ensayo durante 10 minutos.
Repita el ensayo de locomoción a las 96 y 120 horas después de la fertilización. La evaluación de la muerte de células cerebrales utilizando una línea de reportero venoso de Annexin V M ocultada en ubiquitina estuvo en secreto da como resultado grupos claros claros de células moribundas en larvas con hemorragias que están ausentes en todas las larvas no hemorragias indicadas por imágenes verdes de fluorescencia de campo brillante demuestran la presencia de sangrado cerebral. Se observaron células moribundas en modelos de Atorvastatina y cabeza de burbuja para larvas con hemorragias.
La morfología de los macrófagos positivos MPEG1 cambia en la hemorragia intracerebral de larvas positivas a medida que las células adoptan en forma de amoeboides redondeados activos. Estas células redondeadas activadas fueron monitoreadas con el tiempo para mostrar una mayor respuesta fagocítica de la ubiquitina secretada Annexin V M venosa expresando células moribundas en larvas positivas de hemorragia intracerebral. La hemorragia cerebral se asocia con una disminución significativa de la motilidad a las 72 y 96 horas después de la fertilización en comparación con los controles negativos de los hermanos con hemorragia intracerebral.
La motilidad a las 120 horas después de la fertilización se recupera a niveles basales cercanos. El aspecto más importante de este procedimiento es asegurarse de examinar a fondo las larvas para detectar la presencia o ausencia de hemorragias cerebrales antes de proceder a los ensayos de fenotipado. Este modelo también se puede utilizar para la detección de fármacos para determinar si la gravedad del fenotipo se puede mejorar después de un sangrado, un enfoque que puede llevarnos a identificar nuevos candidatos a medicamentos en el futuro.
Esta técnica nos permite explorar las respuestas celulares inmediatamente después de un sangrado en el cerebro durante un punto de tiempo que ha sido tan notoriamente difícil de estudiar antes. Aunque ninguno de los reactivos o instrumentos descritos en este protocolo es específicamente peligroso, se deben tomar precauciones y cuidados estándar en todo momento en el uso de productos químicos, objetos punzantes o láseres.
