Целью этого видео-протокола является создание источника и эффективного протокола для эмбриональной мыши нейронной изоляции стволовых клеток и культуры. Здравствуйте, я Марьям Садеги-Заде. Я магистр клеточной и молекулярной биологии в Институте Рояна.
Сегодня я и мой коллега хотим показать вам, как собрать нейронную стволовую клетку из 13 эмбрионов мыши ганглионной высокотемиенции. Здравствуйте, я Бахарех Ализаде-Шурджестан. Я магистр клеточной и молекулярной биологии на кафедре стволовых клеток Института биотехнологии Рояна.
Здравствуйте, я Реза Дехгани-Варнамхати. Также я изучаю клеточной и молекулярной биологии в Институте Рояна. Хирургические процедуры включают сбор каждых 13 эмбрионов мыши из матки.
Резка передней части фонтанеля эмбриона с согнутой иглой кончик извлечения мозга из черепа. Микро-рассечение изолированного мозга для сбора ганглионной высокотысячи. Диссоциация собранных тканей в среде нервной стволовой клетки, чтобы получить одноклеточную суспензию.
И, наконец, покрытие клеток в культуре суспензии для генерации нервных клеток. Очистите и дезинфицируете кожу брюшной полости, распылив 70% этанола. Управление кожи вверх живота, а затем сократить кожу и подчеркнул лица с ножницами, чтобы раскрыть брюшной полости и рога матки.
Удалите рога матки, содержащие эмбрионы ножницами, и перенесите их в коническую трубку 50 мл, содержащую 25 мл холодного буфера HEPES MEM. Поместите коническую трубку под капотом ламинального потока. Откройте крышку под капотом.
Принесите рога матки из трубки, и промыть три раза с достаточным объемом свежего холодного буфера HEPES MEM для устранения мусора и крови. Перенесите маточную ткань в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую от 7 до 10 мл холодного буфера HEPES MEM. Откройте рога матки с помощью тонких ножниц и перенесите эмбрионы в новое блюдо, содержащее от 7 до 10 мл холодного буфера HEPES MEM.
Теперь поместите 10 см блюдо с эмбрионами под рассечение микроскопа для микро-рассечения операции. Согните кончик шприц-иглы, нажав его кончик на стальной скальпель лезвие ручкой. Согните кончик иглы до тех пор, пока кончик не будет согнут под углом от 70 до 90 градусов.
Проверьте кончик иглы под рассечением микроскопа, чтобы увидеть изгиб на кончике иглы. Естественно, эмбрионы имеют боковое положение в этом. Не изменяя своего положения, ухранил шею и тело эмбриона мелкими типсами, а затем вставил согнутую часть иглы глубоко в переднюю часть фонтанеля головы эмбриона.
Там будет небольшое кровотечение или сгусток крови. Перемещение кончик иглы поверхностно в то время как изогнутая часть находится внутри выпуклость к лбу, а затем к задней части головы. Убедитесь в том, чтобы прорезать кожу и череп, а не повредить основной мозг.
Нажмите кожу кончиком иглы боковой, чтобы раскрыть мозг. Вставьте иглу с боковой стороны кожи под рамой от боковой стороны кожи к области под мозгом. А затем удалить мозг из этой кожи головы, нажав его, чтобы выйти из расчлененного черепа.
Ганглионическое высокопреосвятность четко показано на видео с его медиальной и боковой частей. Провел мозг устойчивый с помощью ухода типсов, а затем с помощью микросхисторов, чтобы сократить коры каждого полушария, чтобы разоблачить ганглийской высокотемиенции. Провел мозг и место расчлененных ганглионной высокотыли в 15 мл центрифуги трубки, содержащей нервной стволовой клетки средств массовой информации.
Повторите эту процедуру до тех пор, пока весь мозг не будет микро-рассечен. Вырезать расчлененные ганглионные возмения, поместив наконечник пипетки против нижней части трубки и пипетки подвески вверх и вниз в течение 2 5 раз, чтобы разбить ткани, чтобы получить одноклеточную подвеску. Центрифуга подвески на 110 г в течение 5 минут.
Удалите супернатант и повторно потеку клетки в 1 мл 0,05%трубки в EDTA. Инкубировать клеточной подвески в 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. А затем добавить эквивалентный объем ингибитора трипсина сои, чтобы остановить активность трипсина.
Pipette ячейки подвески вверх и вниз, чтобы убедиться, что трипсин был полностью инактивирован. Центрифуга клеточной суспензии при 110 г в течение 5 минут. Удалить супернатант и повторного перерасхода клеток в 1 мл полной нервной стволовой клетки среды и подсчитать количество клеток.
Плита клетки на нервной среде стволовых клеток в подходящий размер ткани культуры колбу. Перенесите 5 мл 2T25, 20 мл на T75 и 40 мл в колбы T175. Нейросферы появятся после 3 дней культуры при 37 градусах Цельсия в увлажненные инкубатор с 5%CO2.
Чтобы сосать культуру нейросферы, перенесите среду с подвешенными нейросферами в центрифугу, чтобы центрифугу при 110 г в течение 5 минут, а затем отбросьте супернатант. При 1 мл 0,05%трипсина ЭДТА и инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем инактивировать трипсин с помощью ингибитора соя tyrpsin и пипетки нейросфер мягко вверх и вниз, чтобы сделать их одиночными клетками.
Центрифуга клеточной суспензии при 110 г в течение 5 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно найди клетки в 1 мл нервных стволовых клеток среды. Эти клетки готовы к следующему шагу культуры или культуры на ламинат и полностью покрытием поверхности для передовых экспериментов.
Путем культивировать миллион главным образом нервных стволовых клеток после 7 дней число клеток увеличит до 3 до 4 миллионов. Через шесть-семь дней сферы должны измерять от 150 до 200 микрометров в диаметре и будут готовы к суб-культуре на ламинированной поли орнитинированной посуде при отсутствии bFGF и EGF для нейрональной дифференциации. Результаты анализа цитометрии потока показывают, что около 95% клеток, составляющих нейросферы, были положительными Nestin, который является известным маркером для нервных стволовых клеток.
Анализы с использованием бета-тубулина III и ганглио волокнистых белковых антител показывают, что, культивируя нервные стволовые клетки на покрытой поверхности около 94%, показан фенотип нейронов и около 5%показывают генотип глиала. В этом коротком видео лабораторный метод для быстрой изоляции нервной стволовой клетки от 13 эмбрионов мыши ганглионной высокотемиенции. Я надеюсь, что вы будете успеха в вашей нервной культуры стволовых клеток.
