Наш протокол является первым, что позволяет динамическое измерение поверхностных дыхательных путей жидкости, или ASL рН, в режиме реального времени как под отдыха и после агонист или ингибитор лечения. Этот метод помогает определить ионные каналы и транспортеры, участвующие во внеклеточной регуляции рН, и может быть применен к другим клеточным системам, в которых это важно, таким как рак. Теперь по сравнению с ранее опубликованными методами, этот новый метод относительно прост в работе.
Для этого не требуется специализированное оборудование. И может сделать ASL рН измерений одновременно в нескольких культурах под интерфейсом жидкости воздуха, или тонкой пленки условиях. Важно отметить, что этот новый метод имеет потенциал для оценки последствий новых терапевтических средств, а не только для муковисцидоза, но и для других хронических заболеваний дыхательных путей, таких как астма и ХОБЛ.
После по крайней мере 28 дней культуры, мыть апиальной поверхности дыхательных путей человека эпителиальной клеточной культуры с 150 микролитров бикарбоната, содержащего krebs буферный раствор в течение 20 минут на инкубаторе клеточной культуры. В конце инкубации используйте стерильный стеклянный пипетку со стерильным наконечником трубы P200, связанным с аспираторным насосом, чтобы тщательно аспирировать стирку, не нарушая эпителия. Там должно быть как можно меньше жидкости, оставшейся на апической поверхности, как это возможно, чтобы восстановить интерфейс жидкости воздуха.
Затем верните клетки в инкубатор клеточной культуры в течение 30 минут. Для выполнения фонового измерения включите считыватель пластин и компьютер. После открытия приборной панели нажмите Spark 10M и установите контроль температуры до 37 градусов по Цельсию.
Затем откройте газовый контроль и установите углекислый газ до 5% Когда температура и газ достигли своих целей, откройте ящик считыватель пластин и вставьте кассету влажности, наполненную шестью миллилитров дистиллированной воды с каждой стороны в считыватель. Подтвердите, что крышка и дно пластины культуры ячейки чисты и поместите пластину на кассету влажности, положить крышку обратно и закрыть ящик. Откройте редактор Spark Method, выберите соответствующий шаблон пластины и выберите колодцы, которые будут контролироваться в ходе эксперимента.
Добавьте панель управления температурой и углекислым газом и установите панели до 37 градусов по Цельсию и 5% соответственно. Затем пометьте ожидание температуры/газовых коробок. Добавьте кинетическую панель цикла и выберите продолжительность в качестве типа цикла.
Установите продолжительность до пяти минут и установите интервальный тип эксперимента, чтобы не определить, чтобы получить непрерывное чтение. В кинетической петле используйте функцию перетаскивания и падения, чтобы добавить две панели интенсивности флуоресценции, которые будут индивидуально установлены для чувствительных к рН и рН-нечувствительных флуоресцентных красителей. Установите возбуждение и эмиссию длины волны до 560 и 590 нанометров соответственно для рН-чувствительного красителя.
И 495 и 520 нанометров соответственно для рН-нечувствительных красителей. Установите количество вспышек до 30, а z-позицию до 33 200 для каждого фторфора. Установите несколько считыти на колодец для пользователя определяется, как три на три по кругу с границей 4, 750 микрометров.
Нажмите, чтобы инициировать чтение фонового измерения и нажмите хорошо, чтобы подтвердить, что крышка кассеты влажности на месте. В конце измерения перенесите пластину из считывателя пластины в шкаф безопасности культуры тканей и добавьте три микролитров свежеприготовленного раствора флуоресцентного красителя в апикал-поверхность клеток. Затем верните пластину в инкубатор клеточной культуры на ночь.
Для измерения кинетики откройте файл метода, используемый для фоновых измерений. Когда все параметры будут установлены, откройте ящик для считыватель пластин и вставьте кассету влажности. Поместите чистую пластину в кассету влажности с ее крышкой и нажмите кнопку начать инициировать показания флуоресценции.
Затем нажмите хорошо, чтобы подтвердить, что крышка кассеты влажности на месте. После минимум 12 циклов, нажмите паузу, чтобы прервать эксперимент и удалить пластину базолатерно применять любые препараты или агонистов к соответствующим образцам. Верните пластину в кассету влажности на подносе и перепозиционировать крышку кассеты влажности, прежде чем нажать продолжить, для дальнейшей записи ASL рН и контролировать эффект от лечения.
Для калибровки pH in situ снимите пластину с считывателем пластины и аспирировать базолатеральный раствор. Добавьте 750 микролитров высоко буферного стандартного кривого раствора в базолатеральный отсек и один микролитер раствора к апиальной поверхности. Выключите углекислый газ на считыватель пластины и вернуть пластину к влажности кассеты.
Затем установите считыватель пластин с теми же параметрами, что и продемонстрировано, но без углекислого газа, и начните показания флуоресценции каждые пять минут в течение одного-полутора часов. Для анализа данных выберите все средние данные для каждого образца и, или состояние для обеих длин волн в фоновом файле и скопировать и вставить данные в новый файл. Затем вычислите средний фон для каждой хорошо и каждой длины волны.
После копирования и взрения калибровки и кинетических данных таким же образом вычесть фон из каждой точки данных для каждой длины волны. Для каждой точки времени и каждого образца вычислите соотношение между рН-чувствительным и рН-нечувствительным флуоресценцией. Для каждой точки времени генерируйте стандартную кривую из соотношений и построения известных значений рН на х-оси и соотношений на оси y.
Определите точку времени, в которой коэффициенты стабильны, в соответствии с линейной линией регрессии и получите уравнение для этой линии. Затем вычислите рН для каждой точки времени и вы график рН на оси и время на х-оси. В этом репрезентативном предварительном эксперименте без клеток при том же рН и той же концентрации коэффициенты рН-чувствительных и рН-нечувствительных выбросов отличались в зависимости от объема красителя.
Кроме того, при том же рН и одинаковом объеме различные концентрации красителя обеспечивали различные значения соотношения, что указывает на то, что изменения в объеме или концентрации красителя влияют на абсолютное значение рН, рассчитанное на основе коэффициента выбросов. Кроме того, время, необходимое для эквилибрации температуры, составляет примерно от 15 до 20 минут независимо от объема красителя или концентрации. Значения рН ASL, полученные из единой глобальной стандартной кривой, демонстрируют существенную разницу между немифовисцидозом и муковисцидозом культур.
Принимая во время, ASL рН не значительно отличается между муковисцидозом и не-муковисцидоз дыхательных путей человека эпителиальных клеток, когда рН рассчитывается из независимых стандартных кривых. Поэтому важно создавать независимые кривые калибровки для каждого эксперимента и в рамках каждого эксперимента, для каждого образца донора, так как, когда кривые калибровки усреднены вместе, более высокие значения рН-чувствительных, рН-нечувствительных значений соотношения находятся в муковисцидозных культурах, указывающих на более кислый рН. Как и ожидалось, добавление базолатерального форсколина значительно увеличивает рН ASL только в немифистозных культурах.
Поскольку эти клетки были сохранены в стерильном состоянии, они могут быть вымыты, повторно кормили и использовались через несколько дней для будущих экспериментов. Все биологические образцы человека следует рассматривать как потенциально опасные. Поэтому не забудьте использовать соответствующий уровень содержания под стражей и средства индивидуальной защиты в зависимости от ваших образцов.
Важно выполнить фоновые измерения и калибровки рН для каждого набора образцов, чтобы уменьшить вариабельность между донорами и повысить точность.
