私たちのプロトコルは、安静時およびアゴニストまたは阻害剤処理の後の両方でリアルタイムで気道表面液体(ASL pH)の動的測定を可能にする最初のものです。この方法は、細胞外pH調節に関与するイオンチャネルおよびトランスポーターを同定するのに役立ち、癌などの重要な他の細胞系に適用することができる。以前に公開されたメソッドと比較して、この新しい手法は比較的簡単に実行できます。
特殊な機器は必要ありません。また、空気液体界面、または薄膜条件下で複数培養でASL pH測定を同時に行うことができます。重要なことに、この新しい技術は、嚢胞性線維症だけでなく、喘息やCOPDなどの他の慢性気道疾患に対しても、新しい治療法の効果を評価する可能性を秘めています。
少なくとも28日間培養した後、クレブス緩衝液を含む150マイクロローリットルの重炭酸塩を細胞培養インキュベーター上でヒト気道上皮細胞培養の有端表面を20分間洗浄する。インキュベーションの終わりに、吸引ポンプに連結された無菌P200ピペットチップを有する無菌ガラスピペットを使用し、上皮を破壊することなく洗浄を慎重に吸引する。空気液界面を復元するために、できるだけ少ない液体が有端表面に残っているはずです。
その後、細胞を細胞培養インキュベーターに30分間戻す。バックグラウンド測定を実行するには、プレートリーダーとコンピュータの電源を入れます。ダッシュボードを開いた後、[Spark 10M] をクリックし、温度制御を摂氏 37 度に設定します。
次に、ガスコントロールを開き、温度とガスが目標に達したら二酸化炭素を5%に設定し、プレートリーダーの引き出しを開き、各側に6ミリリットルの蒸留水を充填した湿度カセットをリーダーに挿入します。細胞培養板の蓋と底がきれいであることを確認し、プレートを湿度カセットの上に置き、蓋を元に戻し、引き出しを閉めます。Spark メソッド エディタを開き、適切なプレート テンプレートを選択し、実験中に監視するウェルを選択します。
温度と二酸化炭素コントロールパネルを追加し、パネルを摂氏37度と5%にそれぞれ設定します。その後、温度/ガスボックスの待ち時間をチェックします。運動ループパネルを追加し、ループタイプとして継続時間を選択します。
継続読み取りを得るために、期間を5分に設定し、実験の間隔タイプを未定義に設定します。運動ループ内で、ドラッグアンドドロップ機能を使用して、pH感受性およびpH感受性蛍光色素に個別に設定される2つの蛍光強度パネルを追加します。pH感受性色素の励起波長と発光波長をそれぞれ560ナノメートルと590ナノメートルに設定します。
pH無感症色素に対してそれぞれ495および520ナノメートル。各フルオロフォアのフラッシュ数を 30、z 位置を 33,200 に設定します。4,750マイクロメートルの境界を持つ円で3×3として、ユーザー定義に井戸あたりの複数読み取りを設定します。
開始をクリックしてバックグラウンド測定の読み取りを開始し、[大丈夫]をクリックして、湿度カセットの蓋が所定の位置にあることを確認します。測定の最後に、プレートをプレートリーダーから組織培養用安全キャビネットに移し、作りたてのデキストラン結合蛍光色素溶液を細胞のアプリカル表面に3マイクロリットル添加します。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに一晩戻す。
キネティクスの測定では、バックグラウンド測定に使用する方法ファイルを開きます。すべてのパラメータが設定されたら、プレートリーダーの引き出しを開き、湿度カセットを挿入します。清潔なプレートをカバー付きの湿度カセットに入れ、クリックして蛍光測定値を開始します。
次に、湿度カセットの蓋が所定の位置にあることを確認するために、大丈夫をクリックします。最低12サイクル後、一時停止をクリックして実験を中断し、プレートを取り除き、適切なサンプルに薬物またはアゴニストをバソラター的に適用します。プレートをトレイの湿度カセットに戻し、湿度カセットの蓋を再配置して、続けてクリックする前に、ASL pHをさらに記録し、処理の効果を監視します。
situ pHキャリブレーションでは、プレートリーダーからプレートを取り出し、バソラテラ溶液を吸引します。高バッファリングされた標準曲線溶液の750マイクロリットルをバソラショナルコンパートメントに加え、溶液を1マイクロリットルの溶液を素地表面に加えます。プレートリーダーの二酸化炭素をオフにし、プレートを湿度カセットに戻します。
次に、示されたのと同じパラメータをプレートリーダーに設定しますが、二酸化炭素は含まず、5分ごとに蛍光測定値を1〜1時間半開始します。データ分析では、各サンプルの平均データをすべて選択し、バックグラウンドファイルの両方の波長の条件を選択して、データをコピーして新しいファイルに貼り付けます。次に、各ウェルと各波長の平均背景を計算します。
キャリブレーションとキネティックデータを同じ方法でコピーして貼り付けた後、各波長の各データポイントから背景を差し引きます。各時点とサンプルごとに、pH感受性とpH感受性蛍光との比率を計算します。各時間ポイントについて、比率から標準曲線を生成し、既知の pH 値を x 軸に、y 軸の比率をプロットします。
比率が安定している時点を決定し、線形回帰直線に適合し、この線の方程式を得ます。次に、各時点の pH を計算し、y 軸に pH を、x 軸上の時間をプロットします。この代表的な予備実験では、同じpHと同じ濃度の細胞を含まない、pH感受性およびpH感受性の発光率は、色素の体積によって異なった。
さらに、同じpHと同じ体積において、異なる色素濃度が異なる比率値を提供し、その体積または染料濃度の変化が発光率から算出されたpHの絶対値に影響することを示す。また、温度平衡に要する時間は、染料量や濃度に関係なく約15~20分です。単一のグローバル標準曲線から得られたASL pH値は、非嚢胞性線維症と嚢胞性線維症培養との間に有意な差を示す。
一方、ASL pHは、独立した標準曲線からpHを計算する場合、嚢胞性線維症と非嚢胞性線維症ヒト気道上皮細胞との間で有意に異なっていない。したがって、各実験および各実験内で、各ドナーサンプルについて、較正曲線が一緒に平均化されるときのように、より高いpH感受性、pH感受性比値がより酸性pHを示す嚢胞性線維化培養において見られる独立した較正曲線を生成することが重要である。予想通り、バソラショナルフォルスコリンの添加は、非嚢胞性線維症培養物のみでASL pHを有意に増加させる。
これらの細胞は無菌状態で保たれているため、後日の実験のために洗浄、再供給、使用することができます。すべての生物学的ヒト標本は潜在的に危険であると見なされるべきである。したがって、あなたのサンプルに応じて、適切なレベルの閉じ込めと個人用保護具を使用してください。
ドナー間変動を低減し、精度を向上させるためには、サンプルの各セットに対してバックグラウンド測定とpHキャリブレーションを実行することが重要です。
