Notre protocole est le premier qui permet la mesure dynamique du liquide de surface des voies respiratoires, ou pH ASL, en temps réel sous le repos et après le traitement agoniste ou inhibiteur. Cette méthode aide à identifier les canaux iions et les transporteurs impliqués dans la régulation extracellulaire du pH et pourrait être appliquée à d’autres systèmes cellulaires dans lesquels cela est important, comme le cancer. Maintenant comparée aux méthodes précédemment publiées, cette nouvelle technique est relativement simple à exécuter.
Il ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Et peut faire des mesures de pH ASL simultanément dans plusieurs cultures sous interface liquide d’air, ou des conditions de film mince. Fait important, cette nouvelle technique a le potentiel d’évaluer les effets de nouvelles thérapeutiques, non seulement pour la fibrose kystique, mais aussi pour d’autres maladies chroniques des voies respiratoires, comme l’asthme et la MPOC.
Après au moins 28 jours de culture, laver la surface apical d’une culture cellulaire épithéliale des voies respiratoires humaines avec 150 microlitres de bicarbonate contenant la solution tampon Krebs pendant 20 minutes sur l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, utiliser un pipet en verre stérile avec une pointe stérile de pipet P200 reliée à une pompe d’aspiration, pour aspirer soigneusement le lavage sans perturber l’épithélium. Il devrait rester le moins de liquide possible sur la surface apical pour restaurer l’interface liquide de l’air.
Ensuite, retournez les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes. Pour effectuer une mesure de fond, allumez le lecteur de plaque et l’ordinateur. Après avoir ouvert le tableau de bord, cliquez sur Spark 10M et réglez le contrôle de la température à 37 degrés Celsius.
Ensuite, ouvrez le contrôle du gaz et réglez le dioxyde de carbone à 5% Lorsque la température et le gaz ont atteint leurs objectifs, ouvrez le tiroir du lecteur de plaque et insérez une cassette d’humidité remplie de six millilitres d’eau distillée de chaque côté dans le lecteur. Confirmez que le couvercle et le bas de la plaque de culture cellulaire sont propres et placez la plaque sur la cassette d’humidité, ez le couvercle et fermez le tiroir. Ouvrez l’éditeur de la méthode Spark, sélectionnez le modèle de plaque approprié et sélectionnez les puits à surveiller pendant l’expérience.
Ajoutez un panneau de contrôle de la température et du dioxyde de carbone et réglez les panneaux à 37 degrés Celsius et 5 %, respectivement. Ensuite, cochez l’attente pour la température / boîtes à gaz. Ajoutez un panneau de boucle cinétique et sélectionnez la durée comme type de boucle.
Réglez la durée à cinq minutes et définissez le type d’intervalle de l’expérience à ne pas définir, pour obtenir une lecture continue. Dans la boucle cinétique, utilisez la fonction glisser et laisser tomber pour ajouter deux panneaux d’intensité de fluorescence qui seront réglés individuellement pour les colorants fluorescents sensibles au pH et insensibles au pH. Réglez la longueur d’onde d’excitation et d’émission à 560 et 590 nanomètres respectivement pour le colorant sensible au pH.
Et 495 et 520 nanomètres respectivement pour le colorant insensible au pH. Réglez le nombre de flashs à 30 et la position z à 33 200 pour chaque fluorophore. Réglez la lecture multiple par puits à l’utilisateur défini, comme un trois par trois par cercle avec une bordure de 4750 micromètres.
Cliquez pour commencer à initier la lecture de mesure d’arrière-plan et cliquez bien, pour confirmer que le couvercle de la cassette d’humidité est en place. À la fin de la mesure, transférez la plaque du lecteur de plaque à un coffret de sécurité de culture de tissu et ajoutez trois microlitres de solution fluorescente fraîchement préparée de colorant fluorescent dextran-couplé à la surface apical des cellules. Retournez ensuite l’assiette à l’incubateur de culture cellulaire du jour au lendemain.
Pour la mesure cinétique, ouvrez le fichier de méthode utilisé pour les mesures d’arrière-plan. Lorsque tous les paramètres ont été définis, ouvrez le tiroir du lecteur de plaque et insérez la cassette d’humidité. Placez la plaque propre dans la cassette d’humidité avec sa couverture et cliquez sur commencer à initier les lectures de fluorescence.
Ensuite, cliquez bien, pour confirmer que le couvercle de la cassette d’humidité est en place. Après un minimum de 12 cycles, cliquez sur pause pour interrompre l’expérience et retirez la plaque pour appliquer basolaterally tous les médicaments ou agonistes sur les échantillons appropriés. Remettre la plaque sur la cassette d’humidité sur le plateau et repositionner le couvercle de la cassette d’humidité, avant de cliquer continuer, pour enregistrer davantage le pH ASL et surveiller l’effet du traitement.
Pour l’étalonnage in situ du pH, retirez la plaque du lecteur de plaque et aspirez la solution basolateral. Ajoutez 750 microlitres de solution de courbe standard hautement tamponnée au compartiment basolateral et un microlitre de solution à la surface apical. Éteignez le dioxyde de carbone sur le lecteur de plaque et retournez la plaque à la cassette d’humidité.
Réglez ensuite le lecteur de plaque avec les mêmes paramètres que démontrés, mais sans dioxyde de carbone, et commencez les lectures de fluorescence toutes les cinq minutes pendant une à une heure et demie. Pour l’analyse des données, sélectionnez toutes les données moyennes pour chaque échantillon et, ou condition pour les deux longueurs d’onde dans le fichier d’arrière-plan et copier et coller les données dans un nouveau fichier. Calculez ensuite l’arrière-plan moyen de chaque puits et de chaque longueur d’onde.
Après avoir copié et passé les données d’étalonnage et cinétiques de la même manière, soustrayez l’arrière-plan de chaque point de données pour chaque longueur d’onde. Pour chaque point de temps et chaque échantillon, calculez le rapport entre la fluorescence sensible au pH et la fluorescence insensible au pH. Pour chaque point de temps, générer une courbe standard à partir des ratios et tracer les valeurs de pH connues sur l’axe x et les ratios sur l’axe y.
Déterminez le moment où les ratios sont stables, adaptez une ligne de régression linéaire et obtenez l’équation pour cette ligne. Ensuite, calculez le pH pour chaque point de temps et tracez le pH sur l’axe y et le temps sur l’axe x. Dans cette expérience préliminaire représentative sans cellules au même pH et à la même concentration, les rapports d’émission sensibles au pH et au pH différaient selon le volume du colorant.
En outre, au même pH et au même volume, différentes concentrations de colorants ont fourni des valeurs de ratio différentes, ce qui indique que les variations de la concentration de volume ou de colorant affectent la valeur absolue du pH calculée à partir du rapport d’émission. De plus, le temps requis pour l’équilibrage de la température est d’environ 15 à 20 minutes, peu importe le volume ou la concentration de colorants. Les valeurs de pH asl obtenues à partir d’une courbe standard mondiale unique démontrent une différence significative entre les cultures non kystique de fibrose et de fibrose kystique.
Attendu que le pH ASL n’est pas significativement différent entre la fibrose kystique et les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines non kystiques lorsque le pH est calculé à partir de courbes standard indépendantes. Par conséquent, il est important de générer des courbes d’étalonnage indépendantes pour chaque expérience et dans chaque expérience, pour chaque échantillon de donneur, comme lorsque les courbes d’étalonnage sont moyennes ensemble, des valeurs plus sensibles au pH et insensibles au pH se trouvent dans les cultures de fibrose kystique indiquant un pH plus acide. Comme prévu, l’ajout de forskoline basolateral augmente considérablement le pH d’ASL dans les cultures non-cystiques de fibrose seulement.
Comme ces cellules ont été maintenues dans un état stérile, elles peuvent être lavées, réa nourries et utilisées quelques jours plus tard pour de futures expériences. Tous les spécimens humains biologiques doivent être considérés comme potentiellement dangereux. Assurez-vous donc d’utiliser le niveau approprié de confinement et d’équipement de protection individuelle en fonction de vos échantillons.
Il est important d’effectuer les mesures de fond et les étalonnages de pH pour chaque ensemble d’échantillons afin de réduire la variabilité entre donateurs et d’améliorer la précision.
