우리의 프로토콜은 기도 표면 액체, 또는 ASL pH의 동적 측정을 허용 하는 첫 번째, 휴식 및 고뇌또는 억제제 치료 후 모두 에서 실시간으로. 이 방법은 세포 외 pH 조절에 관여하는 이온 채널 및 수송기를 식별하는 데 도움이되며 암과 같은 중요한 다른 세포 시스템에 적용 될 수 있습니다. 이제 이전에 게시된 메서드와 비교하여 이 새로운 기술은 비교적 간단합니다.
특수 장비가 필요하지 않습니다. 그리고 공기 액체 인터페이스, 또는 박막 조건하에서 여러 배양에서 ASL pH 측정을 동시에 할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 새로운 기술은 낭포성 섬유증뿐만 아니라 천식과 COPD와 같은 그밖 만성 기도 질병을 위해 뿐만 아니라 새로운 치료의 효력을 평가할 가능성이 있습니다.
적어도 28일간의 배양 후, 크렙스 버퍼 용액을 함유한 150마이크로리터의 중탄산염을 세포 배양배기에서 20분 동안 인간 기도 상피 세포 배양의 정황표면을 세척한다. 인큐베이션의 끝에서, 포부 펌프에 연결된 멸균 P200 파이프 팁멸균 유리 파이프를 사용하여 상피를 방해하지 않고 조심스럽게 세척을 흡인합니다. 공기 액체 인터페이스를 복원하기 위해 가능한 한 적은 액체가 서피스에 남아 있어야 합니다.
그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 30 분 동안 반환합니다. 백그라운드 측정을 수행하려면 플레이트 판독기와 컴퓨터를 켭니다. 대시보드를 연 후 스파크 10M을 클릭하고 온도 제어를 섭씨 37도로 설정합니다.
그런 다음 가스 제어를 열고 온도와 가스가 목표에 도달하면 이산화탄소를 5 %로 설정하고 플레이트 리더 서랍을 열고 각 측면에 증류수 6 밀리리터로 채워진 습도 카세트를 독자에게 삽입합니다. 세포 배양판의 뚜껑과 바닥이 깨끗하고 플레이트를 습도 카세트에 놓고 뚜껑을 다시 닫고 서랍을 닫습니다. 스파크 방법 편집기를 열고 적절한 플레이트 템플릿을 선택하고 실험 중에 모니터링할 우물을 선택합니다.
온도 및 이산화탄소 제어판을 추가하고 패널을 각각 섭씨 37도, 5%로 설정합니다. 그런 다음 온도 /가스 상자에 대한 대기를 선택합니다. 운동 루프 패널을 추가하고 지속 시간을 루프 유형으로 선택합니다.
지속 시간을 5분으로 설정하고 실험의 간격 유형을 정의하지 않도록 설정하여 연속 판독을 얻습니다. 운동 루프 내에서 드래그 및 드롭 기능을 사용하여 pH 에민감한 및 pH 민감성 형광 염료에 대해 개별적으로 설정된 두 개의 형광 강도 패널을 추가합니다. pH 민감염을 위해 각각 560 및 590 나노미터로 발산 및 방출 파장을 설정합니다.
및 pH-무감각염료에 대해 각각 495 및 520 나노미터. 깜박임 수를 30개로 설정하고 z-위치는 각 형광에 대해 33, 200으로 설정합니다. 4, 750 마이크로미터의 테두리가 있는 3x3x원으로 정의된 사용자별로 여러 읽기를 설정합니다.
시작하려면 배경 측정 읽기를 시작하고 확인을 클릭하여 습도 카세트의 뚜껑이 제자리에 있는지 확인합니다. 측정의 끝에서, 플레이트 판독기에서 조직 배양 안전 캐비닛으로 플레이트를 옮기고 갓 준비된 dextran-결합형 형광 염료 용액3마이크로리터를 세포의 정측 표면에 추가한다. 그런 다음 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.
운동 측정의 경우 백그라운드 측정에 사용되는 메서드 파일을 엽니다. 모든 매개 변수가 설정된 경우 플레이트 판독기 서랍을 열고 습도 카세트를 삽입합니다. 깨끗한 접시를 다습 카세트에 덮고 클릭하여 형광 판독값을 시작합니다.
그런 다음 다습 카세트의 뚜껑이 제자리에 있는지 확인하려면 확인을 클릭합니다. 최소 12사이클 후에 일시 중지를 클릭하여 실험을 중단하고 플레이트를 제거하여 적절한 샘플에 약물이나 작용제를 바갈아 발라주세요. 플레이트를 트레이의 습도 카세트에 반환하고 습도 카세트 뚜껑을 재배치한 후 계속 클릭하여 ASL pH를 추가로 기록하고 치료의 효과를 모니터링합니다.
situ pH 교정의 경우 플레이트 판독기에서 플레이트를 제거하고 바소포측액을 흡인시합니다. 고도로 완충된 표준 곡선 용액 750마이크로리터를 바식자측 구획에 추가하고 한 마이크로리터의 용액을 정량 표면에 추가합니다. 플레이트 판독기의 이산화탄소를 끄고 플레이트를 습도 카세트로 되돌려 놓습니다.
그런 다음 입증된 것과 동일한 매개 변수로 플레이트 판독기를 설정하지만 이산화탄소가 없는 경우 1~1시간 반 동안 5분마다 형광 판독값을 시작합니다. 데이터 분석을 위해 각 샘플에 대한 모든 평균 데이터를 선택하고 백그라운드 파일의 파장에 대한 조건을 모두 선택하고 데이터를 새 파일에 복사하여 붙여넣습니다. 그런 다음 각 웰과 각 파장에 대한 평균 배경을 계산합니다.
교정 및 운동 데이터를 동일한 방식으로 복사하고 붙여넣은 후 각 파장의 각 데이터 점에서 배경을 뺍니다. 각 시간 지점과 모든 샘플에 대해 pH 민감성과 pH 민감형 사이의 비율을 계산합니다. 각 시간점에 대해 비율에서 표준 곡선을 생성하고 x 축과 y축의 비율에 알려진 pH 값을 플롯합니다.
비율이 안정되어 있는 시점을 결정하고 선형 회귀 라인에 맞고 이 선에 대한 방정식을 얻습니다. 그런 다음 각 시간 점에 대한 pH를 계산하고 y축및 x축의 시간에 pH를 플롯합니다. 동일한 pH 및 동일한 농도에서 세포가 없는 대표적인 예비 실험에서, pH 민감성 및 pH-민감성 방출 비율은 염료의 부피에 따라 달랐다.
또한, 동일한 pH 및 동일한 부피에서 상이한 염료 농도는 상이한 비율 값을 제공했으며, 이는 부피 또는 염료 농도의 변화가 배출비로부터 계산된 pH의 절대값에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 또한, 온도 평형에 필요한 시간은 염료 부피 또는 농도에 관계없이 약 15~20분이다. 단일 글로벌 표준 곡선에서 얻은 ASL pH 값은 비 낭포성 섬유증과 낭포성 섬유증 배양 사이의 유의한 차이를 보여줍니다.
반면, ASL pH는 pH가 독립적인 표준 곡선에서 계산될 때 낭포성 섬유증과 비낭포성 섬유증 인간 기도 상피 세포 사이에 유의히 다르지 않다. 따라서, 각 실험및 각 실험 내의 독립적인 교정 곡선을 생성하는 것이 중요하며, 각 기증자 샘플에 대해, 교정 곡선이 함께 평균화될 때, 더 높은 pH 민감성, pH-무감각 비율 값은 낭포성 섬유증 배양에서 더 산성 pH를 나타내는 것으로 나타났다. 예상대로, 바소포린의 첨가는 비낭성 섬유증 배양에서만 ASL pH를 크게 증가시킨다.
이 세포는 멸균 조건의 밑에 보관되었기 때문에, 그(것)들은 세척하고, 재 공급하고 미래 실험을 위해 며칠 후에 이용될 수 있습니다. 모든 생물학적 인간 표본은 잠재적으로 위험한 것으로 간주되어야 합니다. 따라서 샘플에 따라 적절한 수준의 감금 및 개인 보호 장비를 사용해야 합니다.
기증자 간 가변성을 줄이고 정확도를 향상시키기 위해 각 샘플 집합에 대한 배경 측정 및 pH 교정을 수행하는 것이 중요합니다.
