بروتوكولنا هو الأول الذي يسمح للقياس الديناميكي للسائل سطح مجرى الهواء، أو درجة PH، في الوقت الحقيقي تحت كل من يستريح وبعد علاج ناهض أو مثبطات. تساعد هذه الطريقة على تحديد القنوات الأيونية ووسائل النقل المشاركة في تنظيم الـ PH خارج الخلية ويمكن تطبيقها على أنظمة الخلايا الأخرى التي يكون هذا مهمًا فيها ، مثل السرطان. الآن بالمقارنة مع الأساليب المنشورة سابقا، هذه التقنية الجديدة بسيطة نسبيا لتنفيذ.
لا يتطلب معدات متخصصة. ويمكن أن تجعل قياسات درجة اله ASL في وقت واحد في ثقافات متعددة تحت واجهة سائلة الهواء، أو ظروف رقيقة. الأهم من ذلك، هذه التقنية الجديدة لديها القدرة على تقييم آثار العلاجات الجديدة، ليس فقط للتليف الكيسي، ولكن أيضا لأمراض المسالك الهوائية المزمنة الأخرى، مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن.
بعد ما لا يقل عن 28 يوما من الثقافة، وغسل السطح apical من ثقافة خلية الظهارية مجرى الهواء البشري مع 150 ميكرولتر من بيكربونات تحتوي على حل كريبس العازلة لمدة 20 دقيقة على حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، استخدم أنبوب زجاجي معقمة مع طرف أنبوب P200 معقمة مرتبطة مضخة التطلع، لpireate بعناية غسل دون تعطيل ظهارة. يجب أن يكون هناك القليل من السائل المتبقي على سطح apical ممكن لاستعادة واجهة السائل الهواء.
ثم ارجع الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة. لإجراء قياس الخلفية، قم بتشغيل قارئ اللوحة والكمبيوتر. بعد فتح لوحة القيادة، انقر فوق Spark 10M وحدد درجة الحرارة للتحكم في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
ثم افتح التحكم في الغاز وقم بتعيين ثاني أكسيد الكربون إلى 5٪عندما تكون درجة الحرارة والغاز قد وصلت إلى أهدافها ، افتح درج قارئ اللوحة وأدخل كاسيت الرطوبة المملوء بستة ملليلتر من الماء المقطر على كل جانب في القارئ. تأكد من أن غطاء وأسفل لوحة ثقافة الخلية نظيفة ووضع لوحة على كاسيت الرطوبة، ووضع الغطاء مرة أخرى على وإغلاق الدرج. افتح محرر أسلوب Spark ، وحدد قالب اللوحة المناسب وحدد الآبار التي سيتم مراقبتها أثناء التجربة.
إضافة درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون لوحة التحكم وتعيين لوحات إلى 37 درجة مئوية و 5٪ على التوالي. ثم وضع علامة الانتظار لصناديق درجة الحرارة / الغاز. إضافة لوحة حلقة الحركية وحدد المدة كنوع حلقة.
تعيين المدة إلى خمس دقائق وتعيين نوع الفاصل الزمني من التجربة إلى غير محددة، للحصول على قراءة مستمرة. ضمن الحلقة الحركية، استخدم وظيفة السحب والإفلات لإضافة لوحتي كثافة الفلورسنت التي سيتم تعيينها بشكل فردي لأصباغ الفلورسنت الحساسة للدرجات الضوئية وحاملة درجة الH. تعيين الإثارة والطول الموجي للانبعاثات إلى 560 و 590 نانومتر على التوالي للصبغة الحساسة للhH.
و 495 و 520 نانومتر على التوالي للصبغة غير الحساسة للرقم الـ (هـ) تعيين عدد الومضات إلى 30 و ض-الموقف إلى 33،200 لكل fluorophore. تعيين القراءة متعددة في جيدا للمستخدم المعرفة، كما ثلاثة في ثلاثة بدائرة مع حد 4، 750 ميكرومتر.
انقر فوق بدء لبدء قراءة قياس الخلفية وانقر فوق حسنا، للتأكد من أن غطاء كاسيت الرطوبة في مكانه. في نهاية القياس، نقل لوحة من قارئ لوحة إلى خزانة سلامة ثقافة الأنسجة وإضافة ثلاثة microliters من الطازجة إعداد ديكستران- مقرونة محلول صبغ الفلورسنت إلى السطح apical من الخلايا. ثم العودة لوحة إلى الحاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها.
لقياس الحركية، افتح ملف الأسلوب المستخدم لقياسات الخلفية. عندما تم تعيين كل من المعلمات، فتح درج قارئ لوحة وإدراج كاسيت الرطوبة. ضع اللوحة النظيفة في كاسيت الرطوبة مع غلافها وانقر فوق بدء قراءة الفلوريسنس.
ثم انقر فوق حسنا، للتأكد من أن غطاء كاسيت الرطوبة في مكانه. بعد ما لا يقل عن 12 دورات، انقر على وقفة لمقاطعة التجربة وإزالة لوحة لتطبيق basolaterally أي الأدوية أو ناهضات لعينات مناسبة. أعد اللوحة إلى كاسيت الرطوبة على الدرج، ثم أعد وضع غطاء كاسيت الرطوبة، قبل النقر على الاستمرار، لتسجيل درجة ازول درجة الحرارة ومراقبة تأثير العلاج.
للمعايرة في الموقع درجة الH، وإزالة لوحة من قارئ لوحة وpirate الحل القاعدي. أضف 750 ميكرولترات من حل المنحنى القياسي المخزن بشكل كبير إلى المقصورة القاعدية وميكر واحد من الحل إلى السطح الزّامي. إيقاف تشغيل ثاني أكسيد الكربون على قارئ لوحة والعودة لوحة إلى كاسيت الرطوبة.
ثم تعيين قارئ لوحة مع نفس المعلمات كما هو موضح، ولكن مع عدم وجود ثاني أكسيد الكربون، وبدء قراءات الفلوريسنس كل خمس دقائق لمدة ساعة واحدة إلى ساعة ونصف. لتحليل البيانات، حدد كافة البيانات الوسط لكل عينة أو شرط لكل أطوال موجية في ملف الخلفية ثم نسخ ولصق البيانات في ملف جديد. ثم حساب الخلفية الوسط لكل بئر وكل طول موجي.
بعد نسخ ولصق المعايرة والبيانات الحركية بنفس الطريقة، اطرح الخلفية من كل نقطة بيانات لكل طول موجة. لكل نقطة زمنية وكل عينة، حساب النسبة بين درجة الحساسية للرقم التحسسي وفلورسينسي غير حساسة للرقم. لكل نقطة زمنية، قم بإنشاء منحنى قياسي من النسب و قم برسم قيم درجة PH المعروفة على المحور س والنسب على المحور ص.
تحديد نقطة الوقت التي تكون فيها النسب ثابتة، وتناسب خط انحدار خطي والحصول على المعادلة لهذا الخط. ثم، حساب درجة ال PH لكل نقطة وقت و ارسم درجة ال PH على المحور ص والوقت على محور س. في هذه التجربة الأولية التمثيلية بدون خلايا بنفس درجة الH ونفس التركيز، اختلفت نسب الانبعاثات الحساسة للرفس الـ PH وغير الحساسة للرُغيات تبعاً لحجم الصبغة.
وبالإضافة إلى ذلك، وفي نفس درجة حِسّ الانبعاثات وبنفس الحجم، وفرت تركيزات صبغ مختلفة قيماً مختلفة للنسب، مما يشير إلى أن التغيرات في الحجم أو تركيز الصبغة تؤثر على القيمة المطلقة للرقم الـ (PH) المحسوب من نسبة الانبعاثات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الوقت اللازم لتكبيل درجة الحرارة هو حوالي 15 إلى 20 دقيقة بغض النظر عن حجم الصبغة أو التركيز. قيم ASL pH التي تم الحصول عليها من منحنى قياسي عالمي واحد توضح وجود فرق كبير بين التليف غير الكيسي وثقافات التليف الكيسي.
في حين أن, وASL لا يختلف كثيرا بين التليف الكيسي والتليف غير الكيسي الخلايا الظهارية مجرى الهواء البشري عندما يتم حسابها من منحنيات القياسية المستقلة. لذلك، من المهم توليد منحنيات معايرة مستقلة لكل تجربة وداخل كل تجربة، لكل عينة من المتبرعين، كما هو الحال عندما يتم متوسط منحنيات المعايرة معا، يتم العثور على أعلى درجة الحموضة الحساسة، قيم نسبة غير حساسة للدرجات الحموضة في الثقافات التليف الكيسي مما يدل على درجة الحموضة أكثر حمضية. كما هو متوقع، إضافة forskolin الباسطية يزيد بشكل كبير من ASL pH في الثقافات التليف غير الكيسي فقط.
وبما أن هذه الخلايا قد تم الاحتفاظ بها في حالة معقمة، يمكن غسلها وإعادة تغذيتها واستخدامها بعد بضعة أيام لإجراء التجارب المستقبلية. وينبغي اعتبار جميع العينات البشرية البيولوجية على أنها خطرة. لذا تأكد من استخدام المستوى المناسب من الحبس ومعدات الحماية الشخصية اعتمادا على العينات الخاصة بك.
من المهم إجراء قياسات الخلفية ومعايرة درجة الـ PH لكل مجموعة من العينات من أجل تقليل التباين بين المتبرعين وتحسين الدقة.
