Nuestro protocolo es el primero que permite la medición dinámica del líquido superficial de las vías respiratorias, o pH ASL, en tiempo real bajo tratamiento tanto en reposo como después de agonista o inhibidor. Este método ayuda a identificar los canales iónicos y los transportadores involucrados en la regulación del pH extracelular y podría aplicarse a otros sistemas celulares en los que esto es importante, como el cáncer. Ahora en comparación con los métodos publicados anteriormente, esta nueva técnica es relativamente fácil de realizar.
No requiere equipo especializado. Y puede hacer mediciones de pH ASL simultáneamente en múltiples cultivos bajo interfaz de líquido de aire, o condiciones de película delgada. Es importante destacar que esta nueva técnica tiene el potencial de evaluar los efectos de las nuevas terapias, no sólo para la fibrosis quística, sino también para otras enfermedades crónicas de las vías respiratorias, como el asma y la EPOC.
Después de al menos 28 días de cultivo, lave la superficie apical de un cultivo celular epitelial de las vías respiratorias humanas con 150 microlitros de bicarbonato que contienen solución tampón Krebs durante 20 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, utilice una pipeta de vidrio estéril con una punta de pipeta P200 estéril vinculada a una bomba de aspiración, para aspirar cuidadosamente el lavado sin interrumpir el epitelio. Debe haber el menor líquido restante en la superficie apical como sea posible para restaurar la interfaz del líquido de aire.
Luego devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos. Para realizar una medición de fondo, encienda el lector de placas y el ordenador. Después de abrir el panel, haga clic en Spark 10M y establezca el control de temperatura en 37 grados Centígrados.
A continuación, abra el control de gas y ajuste el dióxido de carbono al 5%Cuando la temperatura y el gas hayan alcanzado sus objetivos, abra el cajón del lector de placas e inserte un cassette de humedad lleno de seis mililitros de agua destilada a cada lado en el lector. Confirme que la tapa y la parte inferior de la placa de cultivo celular están limpias y coloque la placa en el cassette de humedad, vuelva a colocar la tapa y cierre el cajón. Abra el editor de métodos de Spark, seleccione la plantilla de placa adecuada y seleccione los pozos que se supervisarán durante el experimento.
Agregue un panel de control de temperatura y dióxido de carbono y ajuste los paneles a 37 grados centígrados y 5%, respectivamente. A continuación, marque las casillas de espera para la temperatura/gas. Agregue un panel de bucle cinético y seleccione la duración como tipo de bucle.
Establezca la duración en cinco minutos y establezca el tipo de intervalo del experimento en no definido, para obtener una lectura continua. Dentro del bucle cinético, utilice la función de arrastrar y soltar para agregar dos paneles de intensidad de fluorescencia que se ajustarán individualmente para los tintes fluorescentes sensibles al pH y al pH. Establezca la longitud de onda de excitación y emisión en 560 y 590 nanómetros respectivamente para el tinte sensible al pH.
Y 495 y 520 nanómetros respectivamente para el tinte insensible al pH. Establezca el número de destellos en 30 y la posición z en 33.200 para cada fluoróforo. Establezca la lectura múltiple por pozo en definida por el usuario, como un tres por tres por círculo con un borde de 4. 750 micrómetros.
Haga clic en iniciar la lectura de la medición de fondo y haga clic en OK, para confirmar que la tapa del cassette de humedad está en su lugar. Al final de la medición, transfiera la placa del lector de placas a un gabinete de seguridad de cultivo de tejidos y agregue tres microlitros de solución de colorante fluorescente acoplada a dextrán recién preparada a la superficie apical de las células. A continuación, devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante la noche.
Para la medición cinética, abra el archivo de método utilizado para las mediciones de fondo. Una vez ajustados todos los parámetros, abra el cajón del lector de placas e inserte el cassette de humedad. Coloque la placa limpia en el cassette de humedad con su cubierta y haga clic en start para iniciar las lecturas de fluorescencia.
A continuación, haga clic en OK, para confirmar que la tapa del cassette de humedad está en su lugar. Después de un mínimo de 12 ciclos, haga clic en pausa para interrumpir el experimento y retirar la placa para aplicar de forma basolateral cualquier fármaco o agonista a las muestras apropiadas. Vuelva a colocar la placa en el cassette de humedad de la bandeja y vuelva a colocar la tapa del cassette de humedad, antes de hacer clic en continuar, para registrar aún más el pH ASL y para controlar el efecto del tratamiento.
Para la calibración in situ del pH, retire la placa del lector de placas y aspire la solución basolateral. Agregue 750 microlitros de solución de curva estándar altamente amortiguada al compartimiento basolateral y un microlitro de solución a la superficie apical. Apague el dióxido de carbono en el lector de placas y devuelva la placa al cassette de humedad.
A continuación, ajuste el lector de placas con los mismos parámetros que se han demostrado, pero sin dióxido de carbono, e inicie las lecturas de fluorescencia cada cinco minutos durante una hora y media. Para el análisis de datos, seleccione todos los datos medios para cada muestra y o condición para ambas longitudes de onda en el archivo de fondo y copie y pegue los datos en un nuevo archivo. A continuación, calcule el fondo medio para cada pozo y cada longitud de onda.
Después de copiar y pegar los datos de calibración y cinéticos de la misma manera, reste el fondo de cada punto de datos para cada longitud de onda. Para cada punto de tiempo y cada muestra, calcule la relación entre la fluorescencia sensible al pH y la fluorescencia insensible al pH. Para cada punto de tiempo, genere una curva estándar a partir de las relaciones y trace los valores de pH conocidos en el eje X y las relaciones en el eje Y.
Determine el punto de tiempo en el que las relaciones son estables, ajuste una línea de regresión lineal y obtenga la ecuación para esta línea. A continuación, calcule el pH para cada punto de tiempo y trace el pH en el eje Y y el tiempo en el eje X. En este experimento preliminar representativo sin células con el mismo pH y la misma concentración, las relaciones de emisión sensibles al pH e insensibles al pH diferían dependiendo del volumen del tinte.
Además, al mismo pH y el mismo volumen, diferentes concentraciones de tinte proporcionaron diferentes valores de relación, lo que indica que los cambios en el volumen o la concentración del tinte afectan al valor absoluto del pH calculado a partir de la relación de emisión. Además, el tiempo necesario para el equilibrio de temperatura es de aproximadamente 15 a 20 minutos, independientemente del volumen o la concentración del tinte. Los valores de pH ASL obtenidos a partir de una única curva estándar global demuestran una diferencia significativa entre la fibrosis no quística y los cultivos de fibrosis quística.
Mientras que, el pH ASL no es significativamente diferente entre la fibrosis quística y las células epiteliales humanas de las vías respiratorias no quísticas cuando el pH se calcula a partir de curvas estándar independientes. Por lo tanto, es importante generar curvas de calibración independientes para cada experimento y dentro de cada experimento, para cada muestra de donante, ya que cuando las curvas de calibración se promedian juntas, se encuentran valores más altos de relación sensible al pH e insensible al pH en cultivos de fibrosis quística que indican un pH más ácido. Como era de esperar, la adición de forskoline basolateral aumenta significativamente el pH ASL en cultivos de fibrosis no quística solamente.
Como estas células se han mantenido bajo condición estéril, pueden ser lavadas, re-alimentadas y utilizadas unos días más tarde para futuros experimentos. Todos los especímenes biológicos humanos deben considerarse potencialmente peligrosos. Así que asegúrese de utilizar el nivel adecuado de confinamiento y equipo de protección personal dependiendo de sus muestras.
Es importante realizar las mediciones de fondo y las calibraciones de pH para cada conjunto de muestras con el fin de reducir la variabilidad entre donantes y mejorar la precisión.
